Descrizione del modulo "Imaging ottico in modelli bio e nanotecnologici (PM.P04.007.003)"

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  • Descrizione del modulo "Imaging ottico in modelli bio e nanotecnologici (PM.P04.007.003)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • Gli aspetti innovativi del progetto riguardano principalmente l'approccio multidisciplinare e l'utilizzazione di tecnologie avanzate per l'analisi microscopica dei processi cellulari e per la manipolazione dell'espressione genica in sistemi cellulari. L'apporto di nuove conoscenze va primariamente valutato alla luce della potenziale importanza degli avanzamenti delle conoscenze sui meccanismi molecolari dei processi neurodegenerativi per l'individuazione di nuove prospettive terapeutiche, e sul meccanismo alla base delle funzioni cognitive, come l'apprendimento e la memoria, oltre che il processo grazie al quale i circuiti neuronali possono essere riparati in caso di lesioni di varia natura, a seguito di traumi, compressioni, neurodegenerazioni o tumori celebrali. (literal)
Strumentazione
  • All'interno dei laboratori sono presenti le attrezzature e la strumentazione di base per attuare la ricerca proposta, in particolare quanto necessario per le colture cellulari e stabulari controllati per gli animali. Sono inoltre disponibili le attrezzature per Western blotting ed RT-PCR. Per quanto riguarda la strumentazione più specifica sono disponibili: microscopi ottici a trasmissione e fluorescenza, microscopio confocale a scansione laser, microscopio elettronico a trasmissione, unità di elettrofisiologia (patch-clamp), unità per studi comportamentali e sistema per calcium imaging. Sono inoltre disponibili elaboratori e software per l'analisi di immagine, la quantificazione della colocalizzazione in microscopia confocale e l'image processing. Per quanto riguarda il microscopio TIRF, per il momento sono stati utilizzati strumenti posti in visione da parte delle ditte costruttrici (Nikon e Olympus) per periodi limitati di tempo. Si intende inoltre utilizzare \"l'extracellular recording with microelectrode arrays\" (MEAsystem) per stimolare elettricamente le fettine di ippocampo durante la fase di osservazione microscopica. (literal)
Tematiche di ricerca
  • La ricerca si propone di sviluppare in modelli biologici e nanotecnologici tecniche di indagine che utilizzino i sistemi di imaging ottico quali i metodi tridimensionali (confocale, deconvoluzione e multifotone) e i metodi di superficie in particolare la microscopia a fluorescenza in riflessione interna totale (TIRFM). I modelli biologici impiegati saranno il traffico vescicolare di neurotrofine in particolare di BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor). Il BDNF è la molecola neurotrofica maggiormente diffusa nel cervello dei mammiferi. E' stato recentemente dimostrato che il BDNF è rilasciato dal terminale pre-sinaptico e successivamente internalizzato nel neurone post- sinaptico mediante un processo di trans-citosi. Si intende studiare i meccanismi coinvolti nell'internalizzazione del BDNF ed il destino del BDNF endocitato nel terminale post-sinaptico e nelle cellule astrocitarie. I modelli nanotecnologici impiegati saranno le superfici ultrasottili ad alta conducibilità prodotte su ossido di silice. (literal)
Competenze
  • Il curriculum e le pubblicazioni prodotte nel settore negli ultimi anni sono tali da assicurare le competenze scientifiche necessarie per l'esecuzione del progetto. Le strumentazioni presenti e le tecnologie in uso nei laboratori rendono il progetto proposto congruo rispetto al piano sperimentale previsto. Il proponente e i collaboratori hanno dimostrato in anni recenti di essere in grado di gestire con successo progetti di ricerca complessi e finanziati secondo criteri competitivi (Theleton, Cofin, FIRB, AIRC etc.) (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • Lo sviluppo delle tecnologie di imaging ottico, in particolare il TIRF, applicato a modelli bio e nanotecnologici potrà costituire un nuovo strumento di indagine clinico nella visualizzazione dei processi di neurosecrezione, e un nuovo dispositivo di analisi nella produzione delle superfici ultrasottili ad alta conducibilità nel settore biofisico. (literal)
Tecnologie
  • Il microscopio a fluorescenza per riflessione interna totale (abbreviato TIRFM, Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy), è un sistema ottico che permette di visualizzare l'immagine della fluorescenza emessa da elementi luminescenti, quali i fluorofori dispersi in soluzione acquosa, a seguito dell'eccitazione indotta dalla coda evanescente di un campo elettromagnetico. L'onda evanescente viene prodotta per riflessione totale interna alla superficie di contatto tra la soluzione contenente i fluorofori e il supporto della stessa (il vetrino) e si estende per circa 100 nm. I fluorofori che giacciono ad una distanza inferiore a tale valore rispetto la superficie di contatto possono esser eccitati e dar luogo a fluorescenza, mentre quelli che giacciono lontano da essa per più di circa 100 nm non interagiscono con l'onda evanescente e non vengono eccitati. (literal)
Obiettivi
  • Individuazione dei meccanismi alla base di processi neurodegenerativi, che possano essere comuni a patologie neurali di rilevante impatto medico e socio-economico. In particolare verranno studiati i meccanismi molecolari collegati al rilascio astrogliare della neurotrofina BDNF. Individuazione dei meccanismi di regolazione di parametri funzionali, l'alterazione dei quali determina il passaggio da condizioni fisiologiche a condizioni patologiche nei processi neurodegenerativi, con particolare riferimento al deficit cognitivo che si aggrava progressivamente in relazione alla perdita di efficienza sinaptica e plasticità nervosa. In particolare, si studieranno in colture primarie di neuroni ed astrociti ed in preparati ex vivo costituiti da fettine di ippocampo da modelli murini normali o transgenici, il trasporto di BDNF in relazione all'alterata efficienza di trasmissione sinaptica. Inoltre, nei sistemi nanotecnologici, si potrà sviluppare un nuovo dispositivo di analisi nella produzioni di superfici ultrasottili ad alta conducibilità e di materiali multifunzionali. (literal)
Stato dell'arte
  • Il fattore neurotrofico di origine cerebrale (BDNF) ha un ruolo essenziale sia nell'incremento dell'efficacia sinaptica che in meccanismi di neuroprotezione: esso rappresenta quindi un target di primaria importanza per la definizione molecolare dei processi neurodegenerativi, in particolare per quelli nei quali le alterazioni della struttura cerebrale sono accompagnate da deficits cognitivi riconducibili al malfunzionamento della trasmissione sinaptica. Il BDNF rilasciato in conseguenza dell'attivazione pre-sinaptica viene internalizzato dal neurone postsinaptico promuovendo la sua sopravvivenza. E' stato anche ipotizzato che il BDNF rilasciato a livello sinaptico possa essere trasferito ai circostanti astrociti e forse da qui nuovamente ad altri neuroni. Da quanto sopra riassunto, risulta evidente il potenziale ruolo di alterazioni nella produzione e nel traffico inter/intracellulare di BDNF in patologie neurodegenerative, dato il coinvolgimento della proteina nei principali bersagli delle alterazioni neuropatologiche. (literal)
Tecniche di indagine
  • Nostri dati preliminari dimostrano che il BDNF internalizza in vescicole endocitotiche formando un complesso con il proprio recettore TrkB. Allo scopo di caratterizzare la tipologia delle vescicole responsabili dell'internalizzazione di BDNF, si procederà alla immuno-purificazione delle suddette vescicole. A tale scopo verranno utilizzate biglie magnetiche accoppiate con anticorpi in grado di riconoscere il dominio intracellulare dei vari recettori per il BDNF. Le vescicole così purificate verranno analizzate per il loro contenuto proteico mediante la tecnica di Western blot ed immunocitochimica utilizzando anticorpi specifici per le vescicole endosomiali (early-endosomes, late-endosomes or signaling-endosomes) ed anticorpi che riconoscano proteine implicate nei processi di fusione con la membrana plasmatica. Inoltre studieremo il ruolo funzionale del riciclo di BDNF e pro-BDNF in fettine di ippocampo provenienti da topi BDNF (-/-) e (+/-) precedentemente incubate con BDNF. La secrezione di BDNF endocitato durante l'LTP sarà quantificata tramite saggio ELISA nel mezzo di incubazione. (literal)
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