Descrizione del modulo "Cromosomi artificiali per terapia genica. Studi sulla replicazione del DNA in cellule umane ; controllo del ciclo cellulare e della proliferazione. (ME.P05.006.001)"

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  • Descrizione del modulo "Cromosomi artificiali per terapia genica. Studi sulla replicazione del DNA in cellule umane ; controllo del ciclo cellulare e della proliferazione. (ME.P05.006.001)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • Prospettive di applicazioni biotecnologiche nel campo della produzione di proteine ricombinanti, di anticorpi monoclonali e della terapia genica. Prospettive nell'individuazione di nuovi bersagli per terapie antitumorali mirate Prospettive di utilizzare maiali trangenici come fonte di tessuti ed organi per l'uomo (literal)
Tematiche di ricerca
  • Il Modulo riguarda lo studio dei meccanismi che controllano la duplicazione del genoma sia nella fase di inizio che in quella di sintesi, sia durante la progressione del ciclo cellulare che in condizioni di stress replicativo. L'obiettivo è di caratterizzare origini di replicazione umane e di individuare elementi di regolazione dell'attività replicative sia di natura genetica che epigenetica. Le principali tematiche riguardano 1) il ruolo delle origini di replicazione nel controllo della stabilità genomica, nella organizzazione strutturale della cromatina, nella regolazione dell'espressione genica e del loro potenziale impiego biotecnologico per l'espressione di transgeni di interesse biomedico; 2) l'analisi della risposta cellulare allo stress replicativo in sistemi modello di cellule stabilizzate da pazienti affetti da sindromi con predisposizione al cancro e caratterizzate da difetti nei sistemi di controllo del ciclo celluare. (literal)
Competenze
  • Nel laboratorio sono disponibili competenze adeguate allo svolgimento della ricerca che spaziano dalla biologia molecolare e cellulare, alla genetica molecolare, alla citogenetica, alla biochimica e alla bioinformatica. Esse sono continuamente sviluppate e integrate grazie al costante apporto di nuove metodologie e scambio di informazioni tra i componenti afferenti all'Istituto o ai gruppi nazionali ed internazionali con i quali e' attiva una proficua collaborazione scientifica. In particolare il laboratorio è in grado di studiare complessi eventi cellulari grazie ad approcci avanzati di microscopia a fluorescenza: analisi cinetiche di movimento e rilocalizzaione intracellulare mediante FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), e analisi della formazione di complessi proteici in vivo mediante FRET (Fluorescence/Forster Resonance Energy Transfer). Il laboratorio ha inoltre competenze per l'integrazione sito-specifica di vettori, per l'espressione di proteine ricombinanti in batterio, insetto e mammifero e per lo studio di modificazioni epigenetiche della cromatina e di interazioni DNA-proteine in vivo mediante saggi di ChIP su cromatina sonicata o trattata con MNasi. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • Produzione di proteine ricombinanti in cellule umane per potenziali impieghi terapeutici. Impiego di siti genomici permissivi per l'espressione di proteine di interesse biomedico in maiali ingegnerizzati per la produzione di tessuti ed organi da trapiantare nell'uomo Produzione di anticorpi monoclonali come marcatori di proliferazione cellulare. Individuazione di nuovi bersagli per lo screening di sostanze ad azione antiproliferativa e antitumorale. (literal)
Tecnologie
  • Sono stati sviluppati vettori di espressione basati sulla ricombinazione sito-specifica che permettono l'espressione durevole di geni di interesse biomedico in condizioni di assenza di pressione selettiva. Abbiamo inoltre sviluppato una procedura di isolamento e purificazione biomagnetico di cellule esprimenti proteine di interesse biomedico. (literal)
Obiettivi
  • Obiettivi specifici: - Uso di origini di replicazione come elementi per migliorare l'espressione di transgeni di interesse biomedico. -Identificazione e caratterizzazione molecolare di siti genomici del maiale ad espressione ubiquitaria e durevole di transgeni di interesse biomedico. - Costruzione di vettori di espressione amplificabili per cellule umane (cromosomi artificiali) finalizzati alla produzione di proteine di interesse terapeutico. - Individuazione di bersagli molecolari a livello di replicazione del DNA per la terapia dei tumori. - Individuazione di marcatori tumorali - Messa a punto di saggi cell-based per lo screening di sostanze antiproliferative e antitumorali. (literal)
Stato dell'arte
  • I cromosomi artificiali sono un possibile strumento di terapia genica. Inoltre insieme ai vettori integrabili contenenti origini di replicazione, sono promettenti strumenti per la produzione in ambiente fisiologico di fattori terapeutici. Lo sviluppo di nuovi vettori va in parallelo con la comprensione dei meccanismi di replicazione del DNA e dei meccanismi di risposta allo stress replicativo indotto da sorgenti endogene ed esogene di danno al DNA. Il DNA cromosomico è suddiviso in repliconi ciascuno contenete una origine di replicazione bidirezionale. Sull'origine si assemblano i fattori che formano il complesso prereplicativo che captano segnali differenti provenienti dai regolatori del ciclo cellulare e dai checkpoints attivati in risposta al danno sul DNA. Rilevante è anche la relazione tra replicazione del DNA ed organizzazione nucleare: l'organizzazione della cromatina sembra avere peso sempre maggiore nella regolazione spazio-temporale della replicazione. E' quindi importante integrare lo studio delle sequenze richieste per ottenere cromosomi artificiali e/o vettori di integrazione, con l'organizzazione funzionale del nucleo e con il controllo del ciclo cellulare. (literal)
Tecniche di indagine
  • Per lo svolgimento della nostra ricerca ci avvaliamo di metodologie di biologia molecolare classica, biochimica delle protein, biologia cellulare e genetica molecolare. Per lo studio dell'attivita' di innesco di una origine di replicazione umana sono stati sviluppati nuovi approcci che si avvalgono di scanner a fluorescenza e di Real Time PCR e che migliorano il precedente sistema di PCR competitiva gia' sviluppato nel nostro laboratorio. Attraverso la tecnica delle DNA Fibres, recentemente introdotta nel laboratorio, siamo inoltre in grado di analizzare la progressione della replicazione del DNA a livello di singola forca replicativa. Per lo studio dei meccanismi di risposta allo stress replicative sono stati messi a punto protocolli per l'analisi delle modificazioni delle protein mediante 2DGE. Sono stati messi a punto protocolli di purificazione della cromatina con frammentazione sia meccanica (ultrasuoni) che enzimatica ( digestione con DNAsi micrococcale) e procedure di purificazione dei nucleosomi, sia isolati (naked) che in presenza di DNA per verificare possibili interazione tra le proteine da noi studiate e le code istoniche in diverse condizioni. (literal)
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