Descrizione previsione attività della commessa "Meccanismi molecolari della permeabilità di membrana (MD.P01.009)"

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  • Descrizione previsione attività della commessa "Meccanismi molecolari della permeabilità di membrana (MD.P01.009)" (literal)
Iniziative per acquisizione entrate
  • L'attività della commessa è nel campo della ricerca fondamentale di meccanismi biologici. I principali finanziatori sono al momento Telethon, Fondazione per la Ricerca sulla Fibrosi Cistica e Fondazione Compagnia di San Paolo. Nel 2015 verranno sottoposte richieste di finanziamento al progetto europeo malattie rare, a progetti nazionali ministeriali e progetti regionali ed europei. (literal)
Punti critici
  • La produzione di CFTR e TMEM16 ricombinante saranno fatte in cellule di mammifero e dipendono della disponibilità degli strumenti per cromatografia (ai quali non si è potuto fare la manutenzione per mancanza di fondi) e della funzionalità di una ultracentrifuga (in funzione dal 1978 e quindi a rischio di fine servizio). Quest'ultima è anche fondamentale per il frazionamento di membrane cellulari. Si studieranno le proprietà di queste proteine mediante diverse tecniche di biochimica, spettroscopia, elettroforesi ed immunologia, così come misure funzionali di trasporto di iodio e di patch clamp delle proteine ricostituite. Si avanzeranno nuove richieste per l'uso di luce di sincrotrone. La regolazione genica dell'espressione del canale del sodio verrà studiata mediante real time-PCR, per quantificare i geni coinvolti in tale regolazione. Il traffico del canale del sodio verrà studiato mediante misure biochimiche e in fluorescenza al microscopio confocale, e successivamente saranno confrontate con misure funzionali mediante tecniche elettrofisiologiche. Le simulazioni di dinamica molecolare verranno svolte utilizzando i calcolatori in istituto e gli impianti di supercalcolo del CINECA. Le misure di proliferazione e mortalità cellulare in cellule tumorali vengono effettuate con rilevazioni mediante plate-reader, ma potrebbero essere migliorate dall'acquisizione di uno strumento capace di lavorare anche in fluorescenza, strumento che non si può prevedere di acquisire a breve per mancanza di fondi di investimento. (literal)
Attività da svolgere
  • In collaborazione con l'Università del Piemonte orientale, DISTAV Università di Genova e S.S. Traslazionale Urologica, IST IRCCCS San Martino verrà studiato il ruolo dei canali del calcio di tipo T nella crescita tumorale e verrà esplorata l'azione di polifenoli di origine vegetale sulla sopravvivenza, comunicazione e proliferazione di cellule tumorali. In cellule tumorali della mammella e prostata e in cellule di mesotelioma maligno verrà caratterizzata l'attività di questi canali e verrà studiata l'attività modulatrice di resveratrolo, idrossitirosolo, oleoeuropeina e altri polifenoli derivati da leguminose, mediterranee come la liquerizia o africane. Tali sostanze possono interferire in modo selettivo con i meccanismi di regolazione cellulare dipendenti dal calcio e rappresentare una nuova strategia terapeutica. Proseguirà l'analisi strutturale della CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Proseguirà la produzione e purificazione della proteina completa ottenuta da espressione ricombinante in lieviti e cellule di mammifero e continueranno gli studi strutturali mediante dispersione di raggi-x a basso angolo (SAXS) delle proteine solubilizzate. Si analizzerà il ruolo dei lipidi nella conformazione della CFTR. Si svilupperanno nuovi metodi di ricostruzione tridimensionale delle proteine solubilizzate con detergenti a dati di SAXS. Mediante tecniche di biologia cellulare e molecolare, verrà studiato il ruolo della subunità ²1 del canale del sodio, con particolare enfasi su mutazioni di questa associate a forme di epilessia, sul traffico intracellulare e l'espressione della subunità ±. In collaborazione con IRCCS Gaslini, proseguirà lo studio microreologico delle proprietà del muco di epiteli bronchiali e di pazienti con fibrosi cistica allo scopo di caratterizzare quantitativamente l'effetto di farmaci che agiscono sulla CFTR, il canale del sodio epiteliale ed il controllo del pH extracellulare. Verrà messo a punto un protocollo per la purificazione del canale del cloro attivato dal calcio (TMEM16A) per studi strutturali e funzionali. Proseguirà lo studio dell'interazione del GlialCAM con il CLC-2 e con altri canali della famiglia di proteine CLC. Proseguirà la caratterizzazione dei mutanti del CLC-1 che causano miotonia per comprenderne il meccanismo fisio-patologico. Verrà investigato se alcuni di questi mutanti impattino sull'interazione del CLC-1 con il GlialCAM. Proseguirà lo studio dei canali CLC-K. Utilizzando mutagenesi e cross-linking di cisteine inserite in appropriate posizioni della struttura dei CLC-K e della subunità barttin, si intende investigare le interazioni strutturali, ancora sconosciute, tra il canale e la sua subunità. La stechiometria dell'interazione tra i canali CLC-K e barttin verrà investigata usando il fotobleaching a singola molecola. Proseguirà lo studio dei meccanismi biofisici del trasportatore CLC-5; in particolare esamineremo il blocco del CLC-5 da parte di RT-93 mediante mutagenesi per identificare in dettaglio il sito di legame di questa sostanza. In collaborazione con l'Università di Tubingen, proseguiranno gli studi su topi knock-in mutati a livello del residuo 1649 (L1649Q) del gene del canale del sodio Na(v)1.1, mutazione correlata all'insorgenza di emicrania emiplegica familiare, una forma di emicrania monogenica. Mediante calcium imaging e elettrofisiologia, concluderemo lo studio sulle variazioni di calcio intracellulare in cellule staminali mesenchimali in differenziamento. Si prevede di indagare sul processo di transdifferenziamento osteo-adipocitico delle cellule staminali mesenchimali, un fenomeno il cui sbilanciamento è correlato a patologie quali obesità, fragilità scheletriche, osteoporosi e coinvolto nello sviluppo del mieloma multiplo; inoltre una progressiva diminuzione della osteogenesi a favore dell'adipogenesi accompagna naturalmente l'invecchiamento dell'organismo stesso. Verranno dapprima messi a punto i protocolli per i vari processi di differenziamento e dedifferenziamento. Quindi verrà monitorata la variazione nella concentrazione di calcio basale citoplasmatico, indicatore sensibile dello stato metabolico delle cellule mesenchimali. Soprattutto il processo di transdifferenziamento verrà caratterizzato da un punto di vista morfometrico tramite microscopia olografica digitale (DHM), tecnica che permette di visualizzare il sistema cellulare ricostruendone la morfologia tridimensionale e seguirne le variazioni anche per alcuni giorni. In un altro progetto verranno studiati gli effetti di carica superficiale sul folding di proteine chemiosorbite su oro Accanto alla ricerca sperimentale, molta dell'attività sarà dedicata alla preparazione di pubblicazioni e alla stesura di progetti di ricerca. (literal)
Risultati attesi
  • • Caratterizzazione dell'effetto di polifenoli vegetali sull'attività e sulla crescita di cellule tumorali; • Caratterizzazione del ruolo dei canali del calcio nella transizione da cellule di tumore alla prostata (PCa) dipendenti dall'androgeno a cellule PCa indipendenti dall'androgeno; • Modello molecolare a media risoluzione della CFTR solubilizzata, includendo la corona di detergenti intorno alla proteina; • Profilo del controllo dell'espressione e il traffico intracellulare del canale del sodio; • Misure microreologiche delle proprietà viscoelastiche del muco normale e di cellule e pazienti con fibrosi cistica; • Risultati preliminari di caratterizzazione strutturale del TMEM16A umano • Caratterizzazione di mutanti del CLC-1 e del meccanismo fisio-patologico che causa miotonia; • Studio delle interazioni strutturali tra il canale CLC-K e la subunità barttin; • Caratterizzazione del sito di legame di RT-93 sul trasportatore CLC-5; • Ruolo della mutazione L1649Q del gene del canale del sodio Na(v)1.1 nell'emicrania emiplegica familiare; • Identificazione degli attori molecolari coinvolti nella variazioni di calcio intracellulare in cellule staminali mesenchimali in differenziamento; • Caratterizzazione morfologica mediante microscopia olografica digitale del processo di transdifferenziamento osteo-adipocitico; • Misura degli della carica di superfici d'oro sul folding di proteine ivi chemioassorbite, tramite misure di dissipazione con microbilancia al quarzo elettrochimica; • Messa a punto di protocolli abilitanti per l'implementazione di immunosensori applicabili in ambito di rivelazione e quantificazione di biomarkers da siero umano. (literal)
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