Descrizione della commessa "Patogenesi delle malattie degenerative muscolo-scheletriche - ex (ME.P05.012) Patogenesi delle malattie degenerative muscolo-scheletriche ed HLA correlate, ITOI Sez. BO (ME.P05.014)"

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  • Descrizione della commessa "Patogenesi delle malattie degenerative muscolo-scheletriche - ex (ME.P05.012) Patogenesi delle malattie degenerative muscolo-scheletriche ed HLA correlate, ITOI Sez. BO (ME.P05.014)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • -diagnostica delle patologie muscolo-scheletriche associate a difetti del collagene VI o delle lamine - terapia delle patologie muscolo-scheletriche associate a difetti del collagene VI o delle lamine mediante intervento farmacologico - creazione di un Network Italiano Laminopatie su scala nazionale per il coordinamento dell'attività di ricerca e per l'interazione stabile tra clinici e ricercatori nell'ambito delle laminopatie. Il Network fa riferimento all'IGM e viene coordinato da Giovanna Lattanzi. -creazione di un sito web laminopatie facente accessibile al pubblico e con un'area riservata per il banking di dati: url: https://www.igm.cnr.it/index.php?id=383 - terapia delle patologie osteoarticolari mediante l'utilizzo di biomateriali da impianto (literal)
Strumentazione
  • Microscopio elettronico Jeol (acquisito nel 2011) Microscopio elettronico a trasmissione Philips Microscopio elettronico a trasmissione Zeiss Microscopio a fluorescenzacon telecamera intregrata Nikon Microscopio confocale Nikon (acuisito nel 2013 dagli Istituti Ortopedici Rizzoli, in convenzione quadro). Microscopi rovesciati Zeiss per colture cellulari Apparecchiature per colture cellulari Camere sterili Apparecchiatura per Real-Time RT-PCR Apparecchiature per elettroforesi mono e bi-dimensionale Apparecchiature per trasfezione (Nucleofector, Amaxa) Apparecchiature per Western Blot Crio-microtomi Crio-ultramicrotomi Microtomi per microscopia elettronica Apparecchiature per freeze-fracturing Strumentazione per microanalisi a dispersione di energia (EDS) Software per eleborazione immagini (Photoshop 7, Molecular Dynamics software, Pagemaker) Software per analisi statistica Software per banche dati (Filemaker, altri) Software per gene ontology e ricerca bibliografica (Protein Quest) Altri software di base (literal)
Tematiche di ricerca
  • A) Studio delle alterazioni mitocondriali e della matrice extracellulare in muscolo distrofico. Studio dell'efficacia della terapia con ciclosporina A in colture cellulari primarie da pazienti. B) Interazioni di lamina A/C ed emerina con proteine associate alla cromatina (BAF, 53BP, HDAC, istoni). C) Studio del rimodellamento della cromatina dipendente da pre-lamina A. Studio dell'accumulo di precursore immaturo della lamina A in cellule muscolari in differenziamento e in altri modelli differenziativi. D) Studio dei meccanismi di regolazione trascrizionali e post-traduzionali del livello di prelamina A. E) Patogenesi dell'osteolisi nelle laminopatie. F) Espressione e secrezione di citochine dipendente da lamina A/C. G) Ottimizzazione di biomateriali quali veicolo di cellule per riparare difetti osteo-cartilaginei e verifica mediante opportuni marker dell'avvenuta produzione di matrice ossea o cartilaginea. Studio dell'espressione di proteina chinasi C e di altre molecole di trasduzione del segnale in colture di osteoblasti e condrociti da pazienti con patologie osteo-articolari. H) Studio dell'efficacia di nanoparticelle come veicolanti di RNA antisenso nelle distrofie muscolari. (literal)
Competenze
  • La commessa si avvale dell'esperienza ultradecennale di tecnici e ricercatori impegnati nello studio delle distrofie muscolari, della matrice extracellulare e delle patologie muscolari associate a mutazioni di collagene VI. La commessa si avvale dell'apporto di ricercatori con esperienza pluriennale nel campo della analisi funzionale e morfologica del nucleo effettuata grazie alla provata esperienza in tecniche di colture cellulari, microscopia elettronica e fluorescenza, valutazione di campioni da patologie a carico dell'involucro nucleare, tecniche di biologia molecolare e biochimica. I ricercatori coinvolti hanno identificato in passato difetti dell'organizzazione dell'eterocromatina in nuclei da tessuti e cellule di laminopatici e i meccanismi di segnale intranucleare e di rimodellamento e funzione della cromatina in cellule patologiche. Hanno inoltre un'esperienza decennale nel campo delle laminopatie. L'esperienza di vari anni nella valutazione dei materiali da impianto in grado di veicolare cellule osteo-cartilaginee deriva dalla collaborazione consolidata con gli Istituti Ortopedici Rizzoli. Strumentazione di altissima qualità è disponibile presso l'unità di Bologna. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • -identificazione di nuovi farmaci per la distrofia muscolare di Ullrich, in particolare analoghi della ciclosporina A con effetto non immunodepressivo -identificazione di nuovi farmaci per la distrofia muscolare di Emery-Dreifuss e le altre laminopatie: inibitori delle farnesiltrasferasi in grado di agire sull'accumulo di pre-lamina A farnesilata , in particolare tricostatina A già da noi sperimentata con successo in cellule di progerie e rapamicina. E' stata dimostrata l'efficacia in cellule laminopatiche di anticorpi inibitori anti-TGFbeta2, potenziali farmaci per il trattamento dell'osteolisi in laminopatie. Altri farmaci in grado di ridurre l'overespressione di citochine da noi identificata in EDMD. -perfezionamento di tecniche di diagnostica mediante l'identificazione di marcatori proteici delle diverse laminopatie (prelamina A, emerina, fattori di trascrizione delocalizzati quale il fattore adipogenico SREBP1, citochine a livelli alterati). - ottimizzazione e produzione di biomateriali da impianto -ottimizzazione di nano-bioparticelle come veicolanti di RNA antisenso o farmaci nelle distrofie muscolari (literal)
Tecnologie
  • -allestimento, espansione e conservazione di colture cellulari primarie da campioni bioptici di tessuto muscolare o cutaneo o da midollo osseo umano -analisi in microscopia elettronica, confocale e ottica e relativo allestimento e marcatura dei campioni in immunofluorescenza o immuno-gold -trasfezione mediante vettori eucariotici di cellule umane e murine in coltura stabile e di cellule in coltura primaria e preparazione di costrutti wild-type e mutati -analisi di espressione di vari mRNA in Real-Time RT-PCR -valutazione dei livelli proteici mediante Western blot in lisati cellulari e nucleari e relativa preparazione dei campioni - ELISA di citochine -valutazione di interazioni proteina-proteina e cromatina-proteina mediante co-immunoprecipitazione, Chip-assay, pull-down assay, overlay-assay (literal)
Obiettivi
  • A)Determinazione dei dosaggi corretti per il recupero di difetti strutturali e funzionali, con particolare riferimento alla attività mitocondriale, in colture di mioblasti Ullrich e Bethlem sottoposti a somministrazione di analoghi della ciclosporina A.- Protocolli diagnostici non invasivi per follow up. B)Dosaggi di citochine in laminopatie e ruolo patogenetico. Determinazione della diversa processazione della pre-lamina A in cellule umane normali e da pazienti Emery-Dreifuss, in relazione alla mutazione e al fenotipo clinico (relazione genotipo-fenotipo). C)Determinazione del ruolo della prelamina A nel differenziamento muscolare e osseo e sue interazioni con il LINC complex che ne determina il collegamento al citoscheletro. D)Verifica della produzione di matrice extracellulare da parte di cellule coltivate su biomateriali per la riparazione cartilaginea e ossea. Valutazione di variazioni quantitative di elementi chiave del sistema di trasduzione del segnale inositide-dipendente in cellule da pazienti con patologie osteo-articolari. E) Verifica dell'efficacia di nanoparticelle nella riattivazione della produzione di distrofina, nella terapia della distrofia muscolare di Duchenne (literal)
Stato dell'arte
  • A)Mutazioni del Collagene VI causano la BM e la UCMD caratterizzate da degenerazione muscolare. E' stata dimostrata la validità di modelli cellulari di studio e di biomarcatori (Pellegrini et al., 2012; Sabatelli et al. (a), 2012). Alterazioni di ECM sono state identificate anche in LGMD2I (sabatelli et al (b).2012). B)Mutazioni delle proteine dell'involucro nucleare (lamina A/C e partner funzionali) causano distrofie muscolari, lipodistrofie e progerie. L'accumulo di precursore della lamina A può essere ridotto con rapamicina o trattamento combinato con statine e tricostatina A (Cenni et al., 2012; Camozzi et al., 2014). C)La leucodistrofia ADLD è associata a duplicazione del gene LMNB1 e associata a sequestro e alterata attività trascrizionale del fattore OCT-1 (Columbaro, 2013). D)L'associazione BAF-prelamina A è alla base dell'alterata localizzazione e funzionalità di BAF in cellule laminopatiche (Capanni et al., 2012). E)L'analisi del liquido sinoviale consente un monitoraggio precoce dei danni da impianto di protesi articolare (Stea et al., 2012). E' stato chiarito l'utilizzo di derivati di midollo osseo per il trattamento di lesioni cartilaginee (Cavallo et al.2012). (literal)
Tecniche di indagine
  • Colture cellulari primarie e di linee stabili umane ed eucariotiche Studi di interazione molecolare mediante co-immunoprecipitazione in vivo e pull-down in vitro, PLA. Studi di biologia cellulare con inibitori/induttori, over-espressione o RNA interferenti Differenziamento muscolare, osseo o adipocitario di cellule in coltura Tecniche di biologia molecolare per la produzione di costrutti wild-type o mutati. Analisi in Real-Time RT-PCR di mRNA per vari geni. Analisi di citochine in ELISA. Analisi di proteine nucleari mediante Western blot e immunofluorescenza Analisi di proteine della matrice extracellulare mediante immunofluorescenza, microscopia elettronica e Western blot Analisi della funzionale della cromatina mediante Chip-assay, marcatori proteici e trascrizione in situ. Analisi in microscopia elettronica Espressione di costrutti codificanti per proteine nucleari Tecniche diagnostiche per patologie muscolo-scheletriche (istopatologiche e immunoistochimiche,microscopia elettronica).Microscopia ottica in campo chiaro e a fluorescenza Microscopia elettronica a trasmissione e scansione, rotary shadowing Proteomica funzionale. (literal)
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