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Biochemical characterization of a CDC6-like protein from the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. (Articolo in rivista)

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Biochemical characterization of a CDC6-like protein from the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. (Articolo in rivista) (literal)

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De Felice M., Esposito L., Pucci B., Carpentieri F., De Falco M., Rossi M., Pisani M. (2003)
Biochemical characterization of a CDC6-like protein from the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus.
(literal)

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De Felice M., Esposito L., Pucci B., Carpentieri F., De Falco M., Rossi M., Pisani M. (literal)

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Le proteine Cdc6 hanno un ruolo essenziale nellinizio della replicazione del DNA cromosomale nella cellula eucariotica. Le sequenze genomiche di Archaea contengono geni codificanti per proteine omologhe a Cdc6. Tuttavia sono ancora poco note le proprietà biochimiche di tali proteine. In questa pubblicazione, noi descriviamo la caratterizzazione di uno dei tre putativi fattori simili a Cdc6 del crenarchaeon ipertermofilo Sulfolobus solfataricus (SsoCdc6-1). SsoCdc6-1 è stato super-espresso in Escherichia coli e purificato ad omogeneità. Esperimenti di gel filtrazione ed ultracentrifugazione su gradiente di glicerolo indicano che la proteina è un monomero in soluzione (Mr 45 kDa). Abbiamo dimostrato che SsoCdc6-1 lega molecole di DNA a singolo e a doppio filamento ed è in grado di auto-fosforilarsi in vitro. SsoCdc6-1 possiede una debole attività ATPasica, mentre la proteina con una mutazione puntiforme nel motivo Walker A (Lys59Ala) è del tutto priva di tale attività e non è in grado di auto-fosforilarsi. Abbiamo inoltre dimostrato che SsoCdc6-1 inibisce drasticamente la attività DNA elicasica del complesso MCM-like di S. solfataricus. Questi risultati rappresentano la prima evidenza biochimica di una interazione funzionale tra il complesso MCM ed un fattore Cdc6 ed hanno importanti implicazioni per la comprensione della funzione biologica di Cdc6. (literal)

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Titolo

Biochemical characterization of a CDC6-like protein from the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. (literal)

Abstract

Cdc6 proteins play an essential role in the initiation of chromosomal DNA replication in Eukarya. Genes coding for putative homologs of Cdc6 have been also identified in the genomic sequence of Archaea, but the properties of the corresponding proteins have been poorly investigated so far. Herein, we report the biochemical characterization of one of the three putative Cdc6-like factors from the hyperthermophilic crenarchaeon Sulfolobus solfataricus (SsoCdc6-1). SsoCdc6-1 was overproduced in Escherichia coli as a His-tagged protein and purified to homogeneity. Gel filtration and glycerol gradient ultracentrifugation experiments indicated that this protein behaves as a monomer in solution (molecular mass of about 45 kDa). We demonstrated that SsoCdc6-1 binds single- and double-stranded DNA molecules by electrophoretic mobility shift assays. SsoCdc6-1 undergoes autophosphorylation in vitro and possesses a weak ATPase activity, whereas the protein with a mutation in the Walker A motif (Lys-59 --> Ala) is completely unable to hydrolyze ATP and does not autophosphorylate. We found that SsoCdc6-1 strongly inhibits the ATPase and DNA helicase activity of the S. solfataricus MCM protein. These findings provide the first in vitro biochemical evidence of a functional interaction between a MCM complex and a Cdc6 factor and have important implications for the understanding of the Cdc6 biological function. (literal)

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