Residues at the active site of the esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius involved in substrate specificity and catalytic activity at high temperature (Articolo in rivista)

Type
Label
  • Residues at the active site of the esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius involved in substrate specificity and catalytic activity at high temperature (Articolo in rivista) (literal)
Anno
  • 2001-01-01T00:00:00+01:00 (literal)
Http://www.cnr.it/ontology/cnr/pubblicazioni.owl#doi
  • 10.1074/jbc.M103017200 (literal)
Alternative label
  • Manco G., Mandrich L., Rossi M. (2001)
    Residues at the active site of the esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius involved in substrate specificity and catalytic activity at high temperature
    in The Journal of biological chemistry (Print)
    (literal)
Http://www.cnr.it/ontology/cnr/pubblicazioni.owl#autori
  • Manco G., Mandrich L., Rossi M. (literal)
Pagina inizio
  • 37482 (literal)
Pagina fine
  • 37490 (literal)
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  • Il lavoro si inquadra oltre ché nell’ambito degli studi per la comprensione del rapporto struttura-funzione della prima esterasi da organismo termofilo di cui sia stata risolta la struttura 3D anche nell’ambito dell’applicazione della tecnologia della evoluzione molecolare in vitro, utilizzata per cambiare le proprietà di un’enzima nell’ottica di possibili applicazioni biotecnologiche. Infatti, il lavoro è stato scelto per comunicazioni orali in due congressi internazionali e cioè “International Congress on Biocatalysis 2002” Amburgo, 28-31 Luglio 2002 e “Engineering Enzymes for biocatalysis by using directed evolution” Parigi, Settembre 16-18, 2002. Impact Factor 7.258 (literal)
Http://www.cnr.it/ontology/cnr/pubblicazioni.owl#numeroVolume
  • 276 (literal)
Rivista
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  • 9 (literal)
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  • Lo scopo di questo lavoro è stato quello di disegnare, grazie ad analisi guidata dalla struttura nota dell’ esterasi termofila da Alicyclobacillus acidocaldarius EST2, e di generare, per mutagenesi sito-diretta e di evoluzione molecolare in vitro, dei mutanti di EST2 con un’ alterata specificità di substrato. In particolare lo scopo era di convertire l’esterasi in un enzima più simile ad una lipasi. Tra i vari mutanti ottenuti tre presentavano le caratteristiche desiderate: M211S, R215L, e M211S/R215L. L’analisi cinetica delle proteine mutanti purificate in comparazione con la proteina wild type ha permesso di mostrare che i cambiamenti nella specificità erano dovuti in parte ad un aumento della k(cat) e in parte ad una diminuzione di Km. La specificità del doppio mutante M211S/R215L per il substrato p-nitrofenil decanoato era 6 volte più alta del wild type. Le varianti M211T, M211S, e M211V sebbene non presentassero un forte incremento della costante di specificità mostravano tuttavia un forte incremento dell’attività nei confronti di monoacilesteri con catena acilica di quattro atomi di carbonio. Tali risultati sono tanto più importanti in quanto gli incrementi erano ottenuti a 70°C e per un enzima che già possiede un’elevata kcat. I risultati sono stati interpretati nel contesto della struttura 3D di EST2 e di un meccanismo di reazione in cui k(cat), cioè lo step limitante della reazione era dipendente dalla lunghezza della catena acilica dell’estere. (literal)
Note
  • ISI Web of Science (WOS) (literal)
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  • IBP-CNR (literal)
Titolo
  • Residues at the active site of the esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius involved in substrate specificity and catalytic activity at high temperature (literal)
Abstract
  • The recently solved three-dimensional structure of the thermophilic esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius allowed us to have a snapshot of an enzyme-sulfonate complex, which mimics the second stage of the catalytic reaction, namely the covalent acyl-enzyme intermediate. The aim of this work was to design, by structure-aided analysis and to generate by site-directed and saturation mutagenesis, EST2 variants with changed substrate specificity in the direction of preference for monoacylesters whose acyl-chain length is greater than eight carbon atoms. Positions 211 and 215 of the polypeptide chain were chosen to introduce mutations. Among five variants with single and double amino acid substitutions, three were obtained, M211S, R215L, and M211S/R215L, that changed the catalytic efficiency profile in the desired direction. Kinetic characterization of mutants and wild type showed that this change was achieved by an increase in k(cat) and a decrease in K(m) values with respect to the parental enzyme. The M211S/R215L specificity constant for p-nitrophenyl decanoate substrate was 6-fold higher than the wild type. However, variants M211T, M211S, and M211V showed strikingly increased activity as well as maximal activity with monoacylesters with four carbon atoms in the acyl chain, compared with the wild type. In the case of mutant M211T, the k(cat) for p-nitrophenyl butanoate was 2.4-fold higher. Overall, depending on the variant and on the substrate, we observed improved catalytic activity at 70 degrees C with respect to the wild type, which was a somewhat unexpected result for an enzyme with already high k(cat) values at high temperature. In addition, variants with altered specificity toward the acyl-chain length were obtained. The results were interpreted in the context of the EST2 three-dimensional structure and a proposed catalytic mechanism in which k(cat), e.g. the limiting step of the reaction, was dependent on the acyl chain length of the ester substrate. (literal)
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