Thermoadaptation of a mesophilic hygromycin B phosphotransferase by directed evolution in hyperthermophilic Archaea: selection of a stable genetic marker for DNA transfer into Sulfolobus solfataricus (Articolo in rivista)

Type
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  • Thermoadaptation of a mesophilic hygromycin B phosphotransferase by directed evolution in hyperthermophilic Archaea: selection of a stable genetic marker for DNA transfer into Sulfolobus solfataricus (Articolo in rivista) (literal)
Anno
  • 2001-01-01T00:00:00+01:00 (literal)
Alternative label
  • Cannio R.1, Contursi P.2, Rossi M.1, Bartolucci S.2. (2001)
    Thermoadaptation of a mesophilic hygromycin B phosphotransferase by directed evolution in hyperthermophilic Archaea: selection of a stable genetic marker for DNA transfer into Sulfolobus solfataricus
    in Extremophiles (Tokyo, Print)
    (literal)
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  • Cannio R.1, Contursi P.2, Rossi M.1, Bartolucci S.2. (literal)
Pagina inizio
  • 153 (literal)
Pagina fine
  • 159 (literal)
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  • Il lavoro è stato pubblicato dopo giudizio di referees internazionali su una rivista di notevole diffusione internazionale e di prestigio per quanto riguarda la biologia degli organismi estremofili. La pubblicazione testimonia una larga interdisciplinarietà ed è pionieristica per ciò che concerne la genetica molecolare, microbiologia e chimica delle proteine di organismi archaeali ipertermofili. Infatti é il risultato del successo nel campo dell’ ingegneria genetica e proteica di enzimi ad elevato potenziale applicativo, ed, in quello strutturale, dell’individuazione di motivi strutturali modificabili per l’ottimizzazione dell’ efficienza catalitica degli estremozimi. I risultati descritti hanno dato impulso allo studio di nuovi sistemi genetici adatti come veicoli per il trasferimento e l’espressione di geni di varia origine in questi microrganismi come indicato dalle svariate citazioni in pubblicazioni scientifiche di altri autori. Impact Factor 2.291. (literal)
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  • 5 (literal)
Rivista
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  • Pubblicazione di risultati concernenti la genomica funzionale e genetica manipolativa dell’archaeon S. solfataricus attraverso l’esplorazione delle potenzialità applicative di sistemi di espressione archaeali “a caldo” per l’evoluzione artificiale (nel senso di acquisita termostabilità) di proteine mesofile, attraverso mutagenesi e selezione di varianti termoadattate; il lavoro indica la possibilità di produrre proteine termostabili in via ricombinante, laddove la più classica espressione genica in ospiti mesofili risultasse impedita o quantitativamente scarsa. Il lavoro descrive infatti un vettore shuttle (pEXSs) che può essere replicato e mantenuto in S.solfataricus ed in E.coli: il vettore contiene un gene di origine mesofila (igromicina fosfotransferasi) in grado di conferire resistenza dopo mutagenesi casuale e selezione alle condizioni di crescita del Sulfolobus. Vi è inoltre la caratterizzazione dell’enzima termoadattato in paragone con la versione naturale e la descrizione delle nuove caratteristiche di resistenza alla temperatura acquisite. Il lavoro dimostra l’efficacia delle strategie messe a punto per la trasformazione delle cellule di Sulfolobus dimostrando che il microrganismo è un buon ospite per l’espressione e l’evoluzione artificiale (termoadattamento) di enzimi di fonte mesofila. (literal)
Note
  • ISI Web of Science (WOS) (literal)
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  • 1 CNR, 2 Uni NA Federico II (literal)
Titolo
  • Thermoadaptation of a mesophilic hygromycin B phosphotransferase by directed evolution in hyperthermophilic Archaea: selection of a stable genetic marker for DNA transfer into Sulfolobus solfataricus (literal)
Abstract
  • A mutated version of the hygromycin B phosphotransferase (hph(mut)) gene from Escherichia coli, isolated by directed evolution at 75 degrees C in transformants of a thermophilic strain of Sulfolobus solfataricus, was characterized with respect to its genetic stability in both the original mesophilic and the new thermophilic hosts. This gene was demonstrated to be able to express the hygromycin B resistance phenotype and to be steadily maintained and propagated also in other, more thermophilic strains of S. solfataricus, i.e., up to 82 degrees C. Furthermore, it may be transferred to S. solfataricus cells by cotransformation with pKMSD48, another extrachromosomal element derived from the virus SSV1 of Sulfolobus shibatae, without any loss of stability and without affecting the replication and infectivity of this viral DNA. The hph(mut) and the wild-type gene products were expressed at higher levels in E. coli and purified by specific affinity chromatography on immobilized hygromycin B. Comparative characterization revealed that the mutant enzyme had acquired significant thermoresistance and displayed higher thermal activity with augmented catalytic efficiency. (literal)
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