Descrizione del modulo "La trascrizione come fonte di danno al DNA durante la replicazione del genoma. (SV.P13.001.004)"

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  • Descrizione del modulo "La trascrizione come fonte di danno al DNA durante la replicazione del genoma. (SV.P13.001.004)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • La ricerca si propone di caratterizzare un meccanismo nuovo che genera instabilità genomica e che origina dall'interferenza tra due processi metabolici che interessano la molecola del DNA, la replicazione la trascrizione. Le osservazioni che la deregolazione del metabolismo dell'RNA, attraverso la formazione di ibridi DNA-RNA, possano essere causa d'instabilità genomica sono molto recenti ed hanno, di fatto, aperto un nuovo campo d'indagine che potrebbe portare, come detto sopra, all'identificazione di nuovi bersagli per terapie più mirate contro il cancro e la neurodegenerazione. (literal)
Tematiche di ricerca
  • Lo scopo del nostro studio è di investigare il meccanismo che porta all'instabilità della forcella replicativa negli scontri con la trascrizione in cellule mancanti di Sen1 utilizzando approcci genetici, genomici e di biologia molecolare. In particolare ci proponiamo di i) identificare e caratterizzare i fattori che mediano le transizioni patologiche della forcella replicativa in cellule mancanti di Sen1; ii) studiare quali sono le caratteristiche dei siti fragili nel genoma quando la funzionalità di Sen1 viene compromessa; iii) identificare nuovi fattori che cooperano con Sen1 nel prevenire l'interferenza tra e replicazione e la trascrizione del DNA. A lungo termine il nostro studio vuole contribuire a caratterizzare i meccanismi che portano allo stress replicativo indotto dalla trascrizione DNA e che potrebbero contribuire al processo di trasformazione tumorale. (literal)
Competenze
  • Le competenze necessarie allo svolgimento della ricerca includono: tecniche genetiche di manipolazione dei lieviti e di biologia molecolare. Il progetto prevede inoltre l'uso di tecniche genomiche (sceenings genomici SGA ed esperimenti di ChIP-chip) le quali saranno svolte in collaborazione con l'Istituto Fondazione IFOM di Milano. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • La ricerca si propone di caratterizzare il fenomeno dello stress replicativo che in base a conclusioni tratte da recente letteratura è una delle fonti primarie dei riarrangiamenti genomici osservabili nelle cellule tumorali e in molte malattie associate a neurodegenerazione. Lo scopo principale della ricerca è di raccogliere in breve tempo nuove informazioni su come questi riarrangimenti si verificano, utilizzando come sistema modello un eucariota semplice, quale il lievito S.cerevisiae. Non ci aspettiamo una ricaduta immediata in processi produttivi da questa ricerca. Tuttavia, a lungo termine, la comprensione dei meccanismi che generano instabilità genomica potrebbe aiutare ad identificare nuovi targets per le terapie contro il cancro e/o la neurodegenerazione nell'uomo. (literal)
Tecnologie
  • La ricerca prevede l'uso di tecniche genomiche accanto a procedure più classiche di genetica e biologia molecolare che in particolare verranno applicate sul sistema modello del lievito gemmante. Verranno studiate le interazioni genetiche per Synthetic Genetic Array (SGA) sfruttando una piattaforma robotica. Con questa procedura, un ceppo mutato d'interesse (query) viene incrociato con un libreria di mutanti di lievito contenente delezioni in circa 5000 geni non essenziali (circa l'80% dei geni). Nella progenie meiotica contenente due mutazioni vengono quindi valutati difetti di crescita o soppressione di fenotipi associati al ceppo query. Questa procedura consente di ricostituire rapidamente i pathway genetici appartenenti al fattore d'interesse. Inoltre valutermo, in particolari background genetici, per Chromatin immunoprecipitation e analisi del DNA su chip contenenti il genoma di lievito (ChIP-chip) l'accumulo di proteine specifiche o ibridi di DNA-RNA a livello genomico. (literal)
Obiettivi
  • L'obiettivo principale della ricerca è di caratterizzare come la deregolazione della trascrizione del DNA, interferendo con la replicazione, possa generare riarrangiamenti genomici dipendenti dal pathway della ricombinazione. La nostra idea è di studiare l'interferenza tra questi processi metabolici del DNA in un organismo semplice come il lievito che è facilmente manipolabile dal punto di vista genetico, ma anche utilizzabile per studi genome-wide. Nel nostro laboratorio abbiamo identificato un fattore chiave, la DNA/RNA elicasi Sen1, che è richiesto per coordinare questi processi. L'omologo umano della proteina Sen1, la Senataxina è mutata in due malattie neurodegenerative. Lo scopo del nostro studio è di utlizzare cellule di lievito mutate in Sen1 per caratterizzare le transizioni patologiche della forcella replicativa che attraversa regioni genomiche trascritte dalla RNA polimerasi II. In particolare gli obiettivi principali comprendo i) identificare i fattori che processano la forcella replicativa in assenza di Sen1 e che portano all'accumulo di strutture patologiche di ibridi di DNA-RNA; ii) capire come questi ibridi di DNA-RNA inducono fragilità e riarrangiamenti del DNA. (literal)
Stato dell'arte
  • L'instabilità genomica è associata a tumori e neurodegenerazione nell'uomo ed è causata da eventi di rottura e riparazione aberrante del DNA. Il genoma è particolarmente vulnerabile durante la replicazione, una fase in cui la progressione della forcella replicativa può essere arrestata da strutture secondarie del DNA e proteine stabilmente legate al templato da replicare. Una forcella bloccata è una struttura fragile, incline a rompersi e quindi fonte di riarrangiamenti genomici. Studi nell'uomo e in organismi modello suggeriscono che la trascrizione del DNA può destabilizzare la forcella replicativa. I meccanismi che impediscono i conflitti tra replicazione e trascrizione del DNA sono dunque cruciali anche per preservare l'integrità del genoma. L'inattivazione di questi meccanismi potrebbe avere importanti implicazioni nello sviluppo di patologie associate al cancro e/o neurodegenerazione. I nostri studi si propongono di indagare questi meccanismi in cellule di lievito inattivate per Sen1, una DNA/RNA elicasi conservata nell'uomo e cruciale nel coordinare la replicazione con la trascrizione mediata dalla DNA polimerasi II. (literal)
Tecniche di indagine
  • Il progetto prevede l'utilizzo di tecniche per manipolare, crescere e arrestare nelle diverse fasi del ciclo cellulare con uso di specifici inibitori ceppi di lievito S.cerevisiae. Ci avvaleremo di tecniche di indagine del DNA, RNA e proteine classiche che includono, Southern blot, Northern blot e Western blot; PCR e PCR quantitativa; analsi del contenuto di DNA cellulare per analisi FACS. Il progetto prevede inoltre l'uso estensivo della tecnica per gel elettroforesi bidimensionale che consente di analizzare gli intermedi di replicazione del DNA. Ci avvaleremo inoltre della tecnica di immunoprecipitazione della cromatina per valutare il legame di specifiche proteine o la formazione di ibridi di DNA-RNA sia a specifiche regioni del DNA che a livello genomico. La formazione di rotture del DNA verranno osservate tramite PFGE e/o analisi del DNA genomico estratto e analizzato in gel e i riarrangiamenti genomici saranno valutati con tecniche genetiche. Queste tecniche prevedono l'uso di strumenti per l'analisi elettroforetica delle proteine e degli acidi nucleici, microscopio ottico dotato di micromanipolatore, cetrifughe, termostati, termociclatori, typhoon, FACS e camera radioattiva. (literal)
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