Descrizione del modulo "STUDIO DELL'INTERO TRASCRITTOMA E SUA CORRELAZIONE CON L'ASSETTO GENETICO E FENOTIPICO (ME.P07.006.007)"

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  • Descrizione del modulo "STUDIO DELL'INTERO TRASCRITTOMA E SUA CORRELAZIONE CON L'ASSETTO GENETICO E FENOTIPICO (ME.P07.006.007)" (literal)
Tematiche di ricerca
  • Lo scopo di questa ricerca è il sequenziamento e caratterizzazione del trascrittoma di 1000 individui sardi selezionati tra i volontari del progetto ProgeNIA, mediante l'uso della tecnologia del Next Generation Sequencing (NGS). In particolare ci proponiamo di sequenziare il trascrittoma (RNA-seq) delle cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC). Il punto di forza del progetto consiste nell'enorme vantaggio di poter disporre per i 1000 individui selezionati di approfondite informazioni cliniche, fenotipiche, composizione e struttura delle famiglie, genotipizzazione con vari gene chip arrays e sequenza dell'intero genoma con una copetura 3X. L'analisi bioinformatica e statistica dei dati generati ci permetteranno di: •catalogare tutte le specie dei trascritti, tra cui mRNA, RNA non codificanti e piccoli RNA, che consentono di determinare la struttura della trascrizione dei geni, i modelli di giunzione e le altre modificazioni post-trascrizionali; •quantificare i livelli di espressione e delle loro variazioni; •definire un catalogo di eQTL (expression QTL) e sQTL (splicing QTL) •eseguire studi di associazione su tutto il genoma considerando l'RNA come fenotipo (literal)
Competenze
  • Lo sviluppo del progetto richiede competenze nel campo della biologia molecolare, della genetica e della bioinformatica. Competenze: • biologico/molecolari per: separazione cellulare, preparazione di RNA, di librerie per il sequenziamento del trascrittoma, metodiche di quantificazione dell'espressione come la Real Time PCR,ecc. • biostatistiche, e bioinformatiche: identificazione degli eQTL e degli sQTL, analisi delle sequenze per poter identificare e quantificare i trascritti Tali figure professionali sono presenti nel nostro Istituto o contribuiscono a questo modulo grazie alla collaborazione con Sardegna Ricerche e con il CRS4, a Pula. Per lo svolgimento dell'attività di ricerca il personale del nostro Istituto utilizza la strumentazione a disposizione nei laboratori dell'IRGB presso la sezione di ricerca di Cagliari e Lanusei tra cui amplificatori per PCR, un apparecchio per Real-time PCR, centrifughe, una cappa chimica, un sequenziatore. Grazie alla convenzione stipulata con il CRS4 (Pula) abbiamo accesso alle Piattaforme di Sequenziamento (3 piattaforme Illumina HiSeq 2000 e 2 Illumina GAIIx) e al centro di calcolo, come descritto nel modulo ME.P05.017.004 (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • Le ricerche oggetto di questo modulo saranno effettuate in collaborazione con i moduli ME.P05.017.001, 004,005 e ME.P07.006.001. L'analisi del trascrittoma delle cellule mononucleate del sangue verrà messa in relazione con i dati fenotipici e immunofenotipici disponibili per la coorte ProgeNIA: questo consentirà, oltre che all'identificazione di nuovi RNA codificanti e non, di creare un catalogo di eQTL e sQTL nella popolazione Sarda. Visto il ruolo emergente degli RNA nella regolazione della cromatina, i dati che emergeranno potrebbero essere messi in relazione con i profili epigenetici che risulteranno dal progetto descritto nella proposta di modulo ME.P07.006.005. L'analisi del trascrittoma è di grande rilevanza in quanto fornisce informazioni importanti dal punto di vista funzionale riguardanti lo splicing, l'esistenza di isoforme alternative da un gene, e fenomeni come l'editing dell'RNA, che non sono deducibili dalla sola analisi del DNA. Lo studio del trascrittoma potrebbe permettere quindi l'identificazione di varianti utili per la successiva caratterizzazione di meccanismi funzionali, la cui conoscenza potrà essere utile per studi mirati allo sviluppo di farmaci. (literal)
Obiettivi
  • Nella prima fase del progetto intendiamo caratterizzare il trascrittoma della cellule mononucleate del sangue (PBMC) per 1000 volontari della coorte ProgeNIA, costituiti da trios, per i quali, oltre ad avere a disposizione la sequenza del genoma, si sta procedendo alla caratterizzazione immunofenotipica tramite citofluorimetria (ME.P07.006.006). Gli obiettivi principali sono: • Identificazione di nuovi RNA codificanti e non codificanti, di nuove isoforme e di casi di RNA editing. • Valutazione dei profili di espressione e della loro variazione • Creazione di un catalogo degli eQTL e degli sQTL I PBMC costituiscono una popolazione eterogenea di diversi tipi di cellule, rappresentate in proporzioni variabili. Nella seconda fase del progetto gli obiettivi saranno: • L'identificazione dei tipi cellulari più interessanti basandoci sui risultati dell'analisi degli immunofenotipi • La selezione dei campioni più interessanti in base alla prima fase del progetto sui PBMC, quindi in base all'analisi del loro trascrittoma • Il sequenziamento del trascrittoma di popolazioni cellulari isolate dal sangue dei volontari selezionati in base all'analisi del trascrittoma e agli immunofenotipi. (literal)
Stato dell'arte
  • Le tecnologie di sequenziamento massivo hanno portato, negli ultimi anni, ad una forte espansione delle conoscenze riguardo la sequenza del genoma e del trascrittoma su vari livelli: organismi, tessuti, e cellule. Il sequenziamento dell'RNA ha portato alla scoperta che il genoma è pervasivamente trascritto, quindi non solo in corrispondenza dei geni codificanti proteine, che ne coprono solo una piccola parte. Di pari passo con la scoperta che il genoma è trascritto quasi completamente, sono stati identificati diversi tipi di RNA non codificanti, che agiscono in modi diversi e a vari livelli. Durante gli ultimi 10 anni c'è stata un'esplosione degli studi di associazione genome wide, che ha generato circa 1000 associazioni, che però solo in circa il 10% dei casi è stata dimostrata da un punto di vista funzionale. La maggior parte delle variazioni dell'espressione dell'RNA sono ereditabili e gli studi sull'espressione sul trascrittoma possono aiutare la caratterizzazione e interpretazione dei risultati dei GWAS. (literal)
Tecniche di indagine
  • Questo progetto si basa sull'utilizzo della tecnologia Illumina-Solexa. La metodica consiste nel sequenziamento per sintesi. Vengono costruite delle librerie costituite da frammenti di cDNA alle cui estremità sono legati degli adattomeri che consentono: 1.Il legame dei frammenti su una flow cell (supporto solido simile ad un vetrino da microscopia) 2.Di legare i primers per il sequenziamento per sintesi in parallelo di tutti i frammenti presenti sul supporto Il sequenziamento si basa su una modifica del metodo Sanger, ovvero vengono utilizzati nucleotidi terminatori fluorescenti e reversibili. Attualmente il sistema Illumina permette di sequenziare in parallelo circa 30-40 milioni di frammenti, ognuno dei quali fino a 100 pb ad ogni estremità. Il sequenziamento produce milioni di piccole sequenze che, attraverso metodi informatici e bionformatici e l'utilizzo di algoritmi e software, devono essere allineate al genoma di riferimento ed essere utilizzate per l'identificazione e la quantificazione dei trascritti . (literal)
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