Descrizione del modulo "SEQUENZIAMENTO ESTENSIVO DI ACIDI NUCLEICI DI PIATTAFORME DI ULTIMA GENERAZIONE PER LA DELUCIDAZIONE DI TRATTI E MALATTIE COMUNI E RARE (ME.P05.017.004)"

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  • Descrizione del modulo "SEQUENZIAMENTO ESTENSIVO DI ACIDI NUCLEICI DI PIATTAFORME DI ULTIMA GENERAZIONE PER LA DELUCIDAZIONE DI TRATTI E MALATTIE COMUNI E RARE (ME.P05.017.004)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • Le più innovative tendenze in tema di sanità pubblica indicano che la valutazione del profilo genomico individuale, cioè la determinazione e valutazione delle variabilità di sequenza associate alla suscettibilità di contrarre malattie multifattoriali, rappresenterà un elemento essenziale per un adeguato management dello stato di salute individuale e quindi per la generazione di un più efficace sistema di prevenzione di malattia. Pur essendo allo stato di progetto di ricerca di base la ricerca proposta è in grado di creare le premesse per la risoluzione di problematiche mediche particolarmente rilevanti in Sardegna in termini di diagnosi precoce delle malattie complesse e porre anche la basi per definire nuovi obiettivi di terapia in queste malattie. Inoltre la novità e le potenzialità future dei dati generati da questo progetto possono rappresentare un passo avanti nella realizzazione dell'istituzione di una rete in grado di collegare Centri di Ricerca Regionali, gruppi di ricerca accademici, gruppi di CNR e realtà consolidate del sistema sanitario regionali per il raggiungimento di obiettivi comuni. (literal)
Tematiche di ricerca
  • Le più innovative tendenze in tema di ricerca indicano che la valutazione del profilo genomico individuale mediante la definizione diretta delle variabilità di sequenza rappresenta un elemento essenziale per cercare di chiarire le basi eziopatogenetiche delle malattie e, di conseguenza, la possibilità di evidenziare bersagli terapeutici da utilizzare in approcci clinici volti ad una diagnosi precoce utile alla prevenzione. Il sequenziamento degli acidi nucleici, tramite i sequenziatori di nuova generazione (NGS), rappresenta l'ultimo livello di risoluzione dell'analisi genetico-molecolare e consente di catturare l'informazione completa presente nel genoma e capire quali modificazioni nella sequenza dei geni causano conseguenze sul loro funzionamento.Rispetto alle metodologie iniziali, i NGS sono molto piu efficienti e consentono un approccio massivo, con il sequenziamento automatizzato migliaia di basi. Tale approcio ha determinato una vera e propria rivoluzione nel settore e diventa essenziale per collocarsi in uno scenario internazionale. (literal)
Competenze
  • Il gruppo di ricerca ha a disposizione le piattaforme, l'infrastruttura informatica e il know how per l'espletamento di ciascuna fase sperimentale del progetto. Le competenze presenti sono molteplici e sommano conoscenze che si basano su metodologie di biologia molecolare tradizionali con quelle delle nuove piattaforme tecnologiche. Durante questi anni l'istituto ha utilizzato tecnologie innovative quali ad es i microarrays, che hanno permesso di sviluppare una notevole esperienza nella generazione, gestione e analisi statitica di grandi moli di dati genetici. Nel panorama italiano, il gruppo di ricerca è l'unico che recentemente ha acquisito notevole esperienza nel sequenziamento \"whole genome\" e in tutte le possibili applicazioni di queste nuove strumentazioni in collaborazione con il CRS4 (Centro di Ricerca, Sviluppo e Studi Superiori in Sardegna). Inoltre sono state sviluppate collaborazioni ed interazioni con i gruppi di ricerca del Sanger Institute, del Cancer Centre di Cambridge, della University School of Medicine dell'Università di Stanford. e dell'Università del Michigan che hanno permesso di acquisire e uniformarsi a precisi standard internazionali di qualità. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • Le tematiche portate avanti in questo commessa si iscrivono pienamente nell'ambito di obiettivi strategici considerati di primaria importanza per interventi di promozione della ricerca nell'ambito della protezione della salute umana e nello sviluppo di tecniche di medicina personalizzata. L'attività di ricerca proposta, oltre a contribuire alla comprensione di meccanismi di base e di possibili nuove applicazioni, contiene in sé le potenzialità per un trasferimento tecnologico di metodologie sperimentali nell'ambito dell'identificazione di bersagli terapeutici, protocolli diagnostici e/o prognostici per patologie complesse. Infatti, lo studio dettagliato della sequenza genomica della popolazione sarda portera' all'identificazione di nuove varianti genetiche che potranno essere utilizzate da futuri studi di ricerca per l'identificazione di geni associati alla suscettibilità di malattie e tratti non studiate direttamente dall'Istituto. (literal)
Tecnologie
  • L'attività di ricerca si avvale dell'utilizzo di tecnologie avanzate in biologia molecolare e cellulare per la preparazione e il controllo di qualità dei campioni da sottoporre a sequenziamento e utilizza e sviluppa protocolli per il miglioramento della qualità dei dati e della quantità prodotta. Le strumentazioni da noi impiegate sono in grado di generare circa 8 Terabyte per run in circa 10 giorni, con reads di lunghezza pari a circa 100 nucleotidi. Inoltre sono stati sviluppati e continuamente implementati una serie di tools informatici di avanguardia che consentono di velocizzare e migliorare la gestione della enorme mole di dati genetici prodotti e interfacciarli direttamente con software di analisi statistica impiegati nelle analisi di associazione e integrazione tra dati di sequenza e genotipi, in collaborazione con i moduli ME.P05.017.001, ME.P05.017.005 e commessa ME.P07.006 (literal)
Obiettivi
  • Si propone il sequenziamento di tutto il genoma a bassa coverage (2-4 x) di circa 3500 individui sardi e di origine sarda mediante le piattaforme di sequenziamento di ultima generazione. I dati ottenuti permetteranno la definizione delle varianti genetiche comuni tipiche della popolazione sarda che non sono presenti nei database internazionali e che non verranno identificate dai progetti di sequenziamento in corso su altre popolazioni. I dati derivanti dal sequenziamento estensivo del genoma consentiranno di costruire un pannello di sequenze di riferimento che saranno inferite tramite un approcio bayesiano su tutti i campioni genotipizzati negli studi di associazione, in collaborazione con i moduli ME.P05.017.001, ME.P05.017.005 e commessa ME.P07.006. L'analisi delle sequenze permettera inoltre una definizione piu accurata del linkage disequilibrium nella popolazione sarda , che permettera di generare una lista di marcatori per la costruzione di un chip \"custom\" in grado di correggere le principali lacune nei chip attualmente disponibili. (literal)
Stato dell'arte
  • Negli ultimi anni i risultati degli studi di associazione GWAS hanno evidenziato come l'uso di mappe genetiche con milioni di marcatori e casistiche di migliaia di individui aumentino sensibilmente la probabilità di identificare associazioni vere con malattie multifattoriali. Questi studi risentono pesantemente del fatto che le mappe genetiche utilizzate comprendono varianti comuni e mancano delle varianti rare e/o presenti solo in alcune popolazioni. Questo bias di accertamento è a sua volta legato al piccolo numero di individui sequenziati che sta alla base delle mappe genetiche attuali. In ambito internazionale sono in corso alcuni studi basati sull'uso estensivo dei NGS, che risentono pero di alcune limitazioni: bassa rappresentatività delle varianti genetiche identificabili, confinate a poche popolazioni, e la mancanza di informazioni cliniche negli stessi individui, che non consente di valutare correlazioni genotipo-fenotipo. Si rende necessario perciò ampliare il numero dei soggetti sequenziati ed estendere tale approcio ad altre popolazioni. In questo contesto lo studio della popolazione sarda appare di particolare rilievo per le sua peculiari caratteristiche genetiche. (literal)
Tecniche di indagine
  • Le tecniche d'indagine utilizzate per questa commessa prevedono l'utilizzo del \"sequenziamento per sintesi\" del sistema Illumina che rappresenta per processività, gestione e costi la migliore soluzione disponibile oggi per il progetto tra i sequenziatori NGS. La metodologia si basa sulla sintesi per frammentazione meccanica, di piccoli frammenti di DNA che vengono poi fissate attraverso delle molecole \"linker\" su una cella a flusso (\"flow cell\"). Il sistema inizia a sintetizzare in parallelo la sequenza di DNA complementare a ciascun frammento legato attraverso il metodo di terminazione reversibile che aggiunge un nucleotide alla volta ciascuno recante un marcatore cromatico riconosciuto tramite fluorescenza. Il sistema Illumina permette di osservare sino a 100 milioni di distinte molecole di DNA fissate sulla superficie, e per ogni molecola, può leggere precisamente circa 100-150 paia di basi che possono essere duplicate su estremità opposte del frammento. Le tecniche informatiche prevedono l'utilizzo di algoritmi e software per l'analisi dell'immagine, per la generazione delle sequenze e per l'allineamento contemporaneo delle stesse su un genoma di referenza. (literal)
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