Descrizione del modulo "Studio della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in risposta a stress. Fattori che controllano lo splicing dei mRNA in cellule normali e nei tumori. (SV.P13.001.001)"

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  • Descrizione del modulo "Studio della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in risposta a stress. Fattori che controllano lo splicing dei mRNA in cellule normali e nei tumori. (SV.P13.001.001)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • La ricerca si occupa di un campo di analisi fino ad ora sottovalutati ovvero il ruolo dello splicing alternativo nella progressione tumorale e nella risposta a condizioni stressanti. In particolare studieremo l'effetto dell'alta densità cellulare che nei tumori si accompagna a ipossia e mancanza di nutrienti. In questo senso la ricerca sicuramente migliorerà la nostra comprensione del processo tumorale e potrebbe offrire nuovi e potenzialmente interessanti approcci terapeutici per la cura dei tumori. (literal)
Tematiche di ricerca
  • E' ormai evidente che esistono diversi livelli di regolazione dell'espressione genica. Le modificazioni post-traduzionali rappresentano sicuramente la forma più veloce di risposta cellulare agli stimoli esterni mentre la regolazione trascrizionale identifica il gruppo di geni attivi in una determinata cellula specificandone l'identità. Lo splicing alternativo si pone come un complesso network intermedio ai due precedenti che modula l'espressione dei geni attivi in un determinato tipo cellulare cambiando le proprietà biochimiche/funzioni dei prodotti o la stabilità dei trascritti. Proprio per questo lo splicing alternativo rappresenta un meccanismo ideale per modulare finemente la risposta a stimoli o cambiamenti dell'ambiente in cui è immersa la cellula compreso il micro-ambiente cellulare. La ricerca si propone di comprendere i meccanismi post-trascrizionali che controllano i livelli del fattore di splicing SRSF1, un'oncoproteina coinvolta nella progressione tumorale, in risposta alle condizioni di crescita delle cellule. (literal)
Competenze
  • La commessa ha competenze in: 1) metodiche per lo studio dell'RNA (isolamento di RNA, Northern blotting, trascrizione in vitro, purificazione e clonaggio ed analisi di small RNA, primer extension); 2) biologia cellulare (colture cellulari in varie condizioni di crescita, transfezioni transienti e stabili, immunofluorescenza, ibridazioni in situ, analisi al microscopio confocale di cellule fissate ed in vivo, marcature in vivo); 3) biologia molecolare (clonaggi, espressione di proteine in sistemi eterologhi, RT-PCR e real-time PCR, Immunoprecipitazione, traduzione in vitro, Western blotting, marcatura di proteine in vivo, vaglio di collezioni di cDNA con anticorpi o con saggi funzionali tipo One- Two- e Three- hybrid in lievito; RNA interference; immunoprecipitazioni, analisi per 2D Gel degli intermedi replicativi, chormatin immunoprecipitation); 4) analisi biochimiche (purificazioni di enzimi e frazionamenti cellulari ); 5) genetica del lievito; 6) analisi per 2D gel per lo studio dell'interferenze tra la trascrizione e replicazione del DNA. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • La ricerca si qualifica come una ricerca di base e quindi non è direttamente coinvolta in processi produttivi. Tuttavia alcuni dei prodotti potrebbero avere ricadute in questo senso. Ad esempio, produzione di anticorpi contro proteine di interesse che potrebbero venir sviluppati e commercializzati in collaborazione con ditte operanti nel campo, come ARETA International con cui è già in corso una collaborazione. Inoltre ci aspettiamo che l'analisi dello splicing alternativo possa portare allo sviluppo di kit diagnostici e in prospettiva allo sviluppo di tecnologie per curare lo splicing alternativo di specifici geni nei tumori. L'identificazione dei pathways coinvolti nel mantenimento della stabilita' genomica potra' identificare potenziali nuovi targets nella terapia antitumorale, oltre a generare, come accennato sopra, una serie di reagenti di potenziale valore commerciale. (literal)
Tecnologie
  • Ci avvarremo di differenti tecnologie di Biologia Molecolare e Cellulare, Biochimica e Biologia Computazionale. In particolare svilupperemo modelli cellulari che permetteranno di rispondere a problemi chiave della nostra ricerca come ad esempio il ruolo di differenti vie di segnalazione nella modulazione dello splicing alternativo. In particolare ci occuperemo di chiarire quali tra gli stimoli che si verificano ad alta densità cellulare siano in grado di modulare eventi di splicing alternativo nel 3'UTR dei trascritti per il fattore di splicing SRSF1 indirizzandoli verso la degradazione attraverso il meccanismo del non-sense mediated RNA decay (NMD). (literal)
Obiettivi
  • Abbiamo precedentemente dimostrato che i livelli del fattore di splicing SRSF1 (prima noto con SF2/ASF) giocano un ruolo chiave nel definire l'identità cellulare e nella modulazione della transizione epitelio mesenchimale. Abbiamo anche mostrato che i livelli di SRSF1 vengono regolati principalmente a livello post-trascrizionale grazie ad eventi di splicing alternativo nella regione 3'UTR che inducono la degradazione dei trascritti tramite il non-sense mediated RNA decay (NMD) pathway. L'obiettivo della ricerca è quello di studiare i meccanismi che regolano il profilo di splicing dei trascritti di SRSF1 andando a identificare le proteine e le vie di trasduzione del segnale coinvolte. In particolare studieremo la connessione tra metabolismo cellulare e regolazione dello splicing. Valuteremo inoltre l'effetto che tale regolazione possa avere sulle proprietà staminali delle cellule tumorali. (literal)
Stato dell'arte
  • La quasi totalità dei trascritti dei geni umani subiscono splicing alternativo. La generale deregolazione dei programmi di splicing è una caratteristica comune dei tumori non dovuta a mutazioni geniche bensì ad una alterata attività dei fattori di splicing. I fattori di splicing infatti sono sia bersagli sia effettori delle vie di trasduzione del segnale e la loro attività è modulata in risposta ai cambiamenti nel micro-ambiente del tumore. A tutt'oggi non è chiaro quale siano le vie di trasduzione del segnale che modulano l'attività dei fattori di splicing in condizioni fisiologiche e ancora di più all'interno del microambiente tumorale in cui si verificano stress dovuti a alta densità cellulare, ipossia, danno sul DNA, iper-osmosi, scarsità di nutrienti. Non è altresì chiaro l'impatto che i cambiamenti di attività ed espressione dei fattori di splicing abbiano sui programmi di splicing dei trascritti genici e conseguentemente sulle proprietà delle cellule tumorali. (literal)
Tecniche di indagine
  • Utilizzeremo un modello di Transizione Epitelio Mesenchimale (EMT) basato sulla densità di crescita delle cellule: Cellule Sw480 cresciute a bassa densità mostrano caratteristiche tipicamente mesenchimali mentre ad alta densità esprimono marcatori molecolari e morfologia epiteliale. L'analisi utilizzerà: 1) Saggi di splicing in vivo che basati su impiego di minigeni trasfettati in cellule umane e analisi dei trascritti con RT-PCR; 2) identificazione di vie di trasduzione del segnale coinvolte nella regolazione dello splicing (Western blotting con anticorpi specifici per forme fosforilate di chinasi e inibitori farmacologici); 3) identificazione dei fattori di splicing coinvolti e dei meccanismi che controllano il livello di questi fattori durante EMT in vitro, 4) Uso di oligonucleotidi e siRNA; 4) Produzione di cloni cellulari stabili; 5) costruzione di mutanti in lievito; 6) saggi di chromatin immunoprecipitation per valutare la connessione tra splicing alternativo e organizzazione cromatinica. (literal)
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