Descrizione previsione attività della commessa "Studio della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in risposta a stress. Fattori che controllano lo splicing dei mRNA in cellule normali e nei tumori. (SV.P13.001)"

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  • Descrizione previsione attività della commessa "Studio della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in risposta a stress. Fattori che controllano lo splicing dei mRNA in cellule normali e nei tumori. (SV.P13.001)" (literal)
Iniziative per acquisizione entrate
  • Richieste di finanziamento ad agenzie nazionali e internazionali per la ricerca (AIRC, Cariplo and AICR-UK). Siamo in attesa di conoscere l'esito di una nostra application a CARIPLO e EU ITN. (literal)
Punti critici
  • A- Durante l'anno produrremmo dei cloni che esprimono stabilmente la regione 3'UTR del gene SRSF1. Verificheremo se similmente ai trascritti endogeni quelli codificati dal minigene rimangano confinati nel nucleo cellulare e possano costituire un modello di analisi. Nel caso che la distribuzione sia differente svilupperemo delle tecniche per down-regolare tramite siRNA l'espressione delle isoforme III e IV senza influenzare quella delle isoforma I che codifica per la proteina. Cercheremo di produrre cloni che esprimano stabilmente gli siRNA in modo da poter studiare gli effetti sull'espressione genica. Valuteremo anche la possibilità di utilizzare la tecnologia di CRISPR/Cas Nuclease RNA-guided Genome Editing per sviluppare cloni cellulari non in grado di produrre le isoforme III e IV e vedere l'effetto sulla fisiologia cellulare. B-I) Migliorare l'immunoseparazione e la successiva caratterizzazione tramite spettrometria di massa di .proteine interagenti con Shc3. II) Sviluppare modelli animali in roditore dove si possa approfondire l'importanza della proteina Shc3 nei tumori cerebrali. C- Un punto critico e' legato alla bassa efficienza di trasfezione delle ECs che rende difficile effetturare saggi funzionali in vitro. L'Istituto si sta attrezzando per allestire di una stanza P2. D- Il progetto implica l'uso di alcune tecnologie (SGA e EM) al momento non attuabili nel nostro Istituto, ma che verranno condotti in collaborazione con l'Istituto IFOM di Milano. Un punto critico riguarderà la messa a punto di una strategia per isolare dal resto del genoma le strutture replicative che si formano al locus ARS1211-PDC1-TRX1 in mutanti sen1. La nostra strategia iniziale prevede l'introduzione di due siti I-SceI al lucus in questione in modo per poter separare per digestione la regione interessata dal genoma. Gli intermedi di diverso peso molecolare, e che costituiscono il frammento in replicazione, verrano poi ulteriormente separati su gradiente di saccarosio. L'analisi verrà condotta su campioni di DNA e successivamente su campioni di DNA-RNA per preservare le strutture ibride. E- Cruciale sara individuare i reagenti immunologici efficienti e specifici nell'immunoprecipitare DICER e DROSHA (literal)
Attività da svolgere
  • A- Abbiamo osservato che alcune delle isoforme di splicing dei trascritti di SRSF1 (isoforma III e IV) sono esclusivamente nucleari. C proponiamo di analizzare la funzione di questi non coding RNA nucleari per stabilire: 1) se siano in grado di modulare l'espressione genica sequestrando fattori di splicing; 2) quali siano i meccanismi coinvolti nella loro produzione; 3) la distribuzione dei trascritti nel nucleo e la loro associazione con la cromatina. Per quanto riguarda il punto 2 ovvero i meccanismi coinvolti nella produzione dei trascritti verificheremo il coinvolgimento dell'organizzazione epigenetica della regione del gene SRSF1 corrispondente al 3'UTR. B-Raccolta e preparazione per la conservazione in azoto liquido di campioni di tumori cerebrali primitivi umani ottenuti al momento dell'intervento chirurgico. Estrazione di proteine ed acidi nucleici dai campioni di cui sopra Allestimento di colture cellulari da frammenti di tumori cerebrali umani Espansione e selezione delle colture cellulari mantenute in presenza o assenza di siero fetale Mantenimento di linee stabili ottenute in passato da tumori cerebrali umani ed animali Proseguire l'analisi tramite immunoprecipitazione e successiva separazione con tecniche elettroforetiche di proteine interagenti direttamente od indirettamente con Shc3 in diverse condizioni d'attivazione metabolica delle cellule derivate da tumori cerebrali umani e mantenute in vitro in monostrato o in aggregazione. In collaborazione con il dott. Pierluigi Mauri dell' Institute for Biomedical Technologies del CNR di Segrate mettere a punto tecniche volte a valutare la stabilità delle isoforme della proteina Shc3 in diverse condizioni metaboliche importanti per la sopravvivenza dei tumori cerebrali. C- Il nostro primo obiettivo è quello di chiarire il ruolo del fattore di splicing Nova2 durante il processo di angiogenesi ed identificare nuove isoforme di splicing regolate da Nova2 durante questo processo. A questo scopo ci proponiamo di utilizzare strategie \"high-throughput\" (RNA-Seq) per analizzare il trascrittoma di ECs over- o sotto esprimenti Nova2 già precedentemente generate. Ci concentreremo su quegli eventi di splicing alternativo che interessano geni codificanti per proteine di membrana. Questo perchè siamo interessati ad identificare target terapeutici esposti sulla superficie delle cellule endoteliali (ECs) e facilmente accessibili alle droghe. Gli eventi di splicing alternativo selezionati verranno validati mediante RT-PCR utilizzando: i. un modello di angiogenesi in vitro; ii. ECs sovra-esprimenti il fattore di splicing Nova2; iii. ECs sotto-esprimenti il fattore di splicing Nova2; iv. embrioni di Zebrafish morfanti per Nova2 e rispettivi controlli. D- 1) Caratterizzare le strutture replicative aberranti contenenti ibridi di DNA-RNA che si accumulano in mutanti sen1 e 2) caratterizzare il pathway Sen1-dipendente che protegge l'integrità della forcella replicativa negli scontri con la trascrizione. Per quanto riguarda il primo punto intendiamo applicare un tipo di analisi 2D gel (neutral-denaturing) accoppiata all'uso di sonde a RNA che ci dovrebbero consentire di discriminare se gli intermedi aberranti che si formano al sito ARS1211-PDC1-TRX1 avvengono al templato leading o lagging. Parallelamente vorremmo procedere all'analisi più diretta di questi intermedi di replicazione in mutanti sen1 per microscopia elettronica (EM). A questo scopo prepareremo un ceppo di lievito da cui la regione ARS1211-PDC1-TRX1, e quindi gli intermedi replicativi che qui si formano, possa essere isolata dal resto del genoma, purificata mentre si replica per essere poi osservata per EM. Utilizzando la tecnica del 2D gel per osservare gli intermedi replicativi e di IP-qPCR per osservare gli ibridi di DNA-RNA, intendiamo verificare se gli interattori genetici di Sen1 sono responsabili del processamento degli ibridi in assenza dell'elicasi o cooperano in qualche modo con Sen1 al mentenimento della stabilità della forcella replicativa. Inoltre, sempre allo scopo di caratterizzare il pathway di Sen1, condurremo nuovi screening genomici e genetici volti all'identificazione di soppressori della letalità cellulare dovuta all'assenza di Sen1. E- In futuro studieremo il potenziale coinvolgimento di DICER e DROSHA ai siti di danno al DNA mediante CHIPSEQ e studieremo il loro contributo nel processamento dei lunghi RNA emergenti dai siti di danno del DNA (literal)
Risultati attesi
  • A- Ci aspettiamo di isolare cloni di cellule umane che esprimano particolari isoforme dei trascritti di SRSF1 e di comprendere l'effetto sull'espressione genica tramite esperimenti di RNA Seq. B-Pubblicazione di un lavoro descrittivo dell'importanza della proteina Shc3 nei gliomi ad alto grado nel controllo dell'attivazione dei trasportatori di glucoso quali GLUT1 e GLUT3. C- Ci aspettiamo di: 1) Validare il fattore di splicing Nova2 come nuovo regolatore dell'angiogenesi; 2) Identificare nuove isoforme di splicing alternativo regolate da Nova2 durante l'angiogenesi; 3) Selezionare geni per proteine di membrana con esoni alternativi che codificano domini esposti sulla superficie delle cellule; 4) Validare I geni selezionati nei diversi sistemi cellulari messi a disposizione dai nostri collaboratori. D- Lo scopo principale del progetto è capire le transizioni patologiche a cui va incontro la forcella replicativa che si scontra con l'apparato trascrizionale in assenza di Sen1. Ci proponiamo di 1) verificare l'applicabilità di tecniche nuove per lo studio di intermedi replicativi nascenti e strutture replicative aberranti contenente ibridi di DNA-RNA in mutanti sen1 e 2) identificare nuovi fattori che rimuovono gli ibridi di DNA-RNA alla forcella replicativa e/o contribuiscono alla sua stabiltà durante gli scontri con la trascrizione. E- Ci aspettiamo di comprendere meglio la biogenesi dei DDRNA mediante lo studio dei loro precursori. (literal)
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