Descrizione della commessa "Meccanismi di regolazione metabolica negli eritrociti di organismi polari (TA.P02.036)"

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  • Descrizione della commessa "Meccanismi di regolazione metabolica negli eritrociti di organismi polari (TA.P02.036)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • La determinazione delle caratteristiche strutturali responsabili dello scarso effetto della temperatura sul ciclo di ossigenazione-desossigenazione di alcune emoglobine di animali polari potrebbe permettere di ottenere, attraverso l'ingegneria genetica, una emoglobina artificiale insensibile alle variazioni di temperatura. In altre parole, il rilascio di ossigeno a livello dei tessuti non sarebbe drasticamente inibito, come accade nell'uomo, alle basse temperature. La possibile applicazione è principalmente in campo biomedico e riguarda la conservazione degli organi da trapianto e particolari interventi chirurgici. (literal)
Strumentazione
  • Lo studio proposto dalla commessa si avvarrà di: - tecniche spettrofotometriche per lo studio delle proprietà funzionali delle emoglobine in analisi; - uso dell'NMR per lo studio della glicolisi, della via dei pentoso fosfati e delle loro interrelazioni ossigeno-dipendenti; - tecniche di chimica computazionale per lo studio della relazione struttura-funzione; - Tecniche di biochimica cellulare per l'analisi dei componenti di membrana e del citoscheletro; - Tecniche di biochimica analitica per la determinazione qualitativa e quantitativa di metaboliti; - Isolamento e purificazione di acidi nucleici (DNA genomici e RNA messaggeri) da tessuti animali freschi, congelati o pellet cellulari; - Clonazione di isoforme geniche (ortologhe) di proteine umane di interesse biologico e medico; - Espressione e purificazione di proteine e peptidi ricombinanti in cellule batteriche e animali; - Mutagenesi sito-diretta; - Trasfezione di cellule animali con costrutti genici wild-type, mutati o chimerici ed analisi di espressione (targeting) con tecniche di immunofluorescenza o di fluorescenza intrinseca (GFP-tagging); - Produzione ed analisi di topi transgenici overesprimenti forme mutate. (literal)
Tematiche di ricerca
  • La nostra ipotesi di lavoro e' che l'associazione-dissociazione dell'Hb con l'ossigeno regoli il metabolismo dell'eritrocita attraverso un meccanismo che prevede l'interazione desossi-Hb e/o enzimi-glicolitici e Banda 3. Le tematiche di ricerca saranno quindi: 1- Determinazione della esistenza (e quindi della generalita') della modulazione ossigeno-dipendente del metabolismo in eritrociti di varie specie, anche in relazione al particolare habitat della specie considerata e con particolare riguardo alle specie antartiche e sub-antartiche. 2- Studio delle modificazioni chimiche a livello molecolare e cellulare indotte da stress ossidativo e loro effetto metabolico. 3- Studio dei dettagli strutturali dell'interazione Hb/Banda 3 per mezzo di tecniche di \"computer chemistry\". 4- Studi dei meccanismi di produzione e di rilascio dell'ossido nitrico da parte degli eritrociti di animali antartici, artici e sub-polari. (literal)
Competenze
  • Il progetto di Commessa utilizzera' competenze di biochimica, biologia cellulare, biologia molecolare, microbiologia, cristallografia, spettroscopia, filogenesi molecolare, fisiologia, modellistica molecolare, metagenomica. La purificazione delle proteine di interesse avverrà mediante tecniche biochimiche classiche; caratterizzazione strutturale di proteine mediante diverse tecniche spettrometriche e spettroscopiche (ad esempio, MALDI-MS, LC-ES/MS/MS, spettroscopia UV-visible, fluorescenza, dicroismo circolare, EPR, spettroscopia Raman, etc.); sarà effettuata la caratterizzazione funzionale delle proteine purificate; cristallografia ad alta risoluzione; registrazione dei dati di diffrazione mediante generatore ad anodo rotante; misure ad alta risoluzione dei dati di diffrazione mediante la \"luce di sincrotrone\"; creazione di modelli molecolari mediante \"Silicon Graphics workstation\". Saranno utilizzate tecniche microbiologiche per la selezione e coltivazione di alcuni taxa batterici dai campioni ambientali antartici. Clonaggio dei geni di interesse mediante tecniche classiche di biologia molecolare; produzione di proteine ricombinanti. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • La comprensione dei determinanti strutturali della sensibilità di enzimi antiossidanti e proteine respiratorie alle variazioni della temperatura è una tappa ineludibile per la produzione di molecole ingegnerizzate che possano assolvere alla loro funzione anche a bassa temperatura. Questo tipo di molecola potrebbe avere importanti applicazioni per la conservazione di alimenti sia di origine animale che vegetale. (literal)
Obiettivi
  • La nostra ipotesi di lavoro e' che l'associazione-dissociazione dell'Hb con l'ossigeno regoli il metabolismo dell'eritrocita attraverso un meccanismo che prevede l'interazione desossi-Hb e/o enzimi-glicolitici e Banda 3. Obiettivo a lungo termine della ricerca proposta e' approfondire il ruolo ed i meccanismi che sono alla base della regolazione fisiologica del metabolismo degli eritrociti. Finalita' specifiche sono: 1- Determinazione della esistenza (e quindi della generalita') della modulazione ossigeno-dipendente del metabolismo in eritrociti di varie specie, anche in relazione al particolare habitat della specie considerata e con particolare riguardo alle specie antartiche e sub-antartiche. 2-Studio delle modificazioni chimiche a livello molecolare e cellulare indotte da stress ossidativo e loro effetto metabolico. 3- Studio dei dettagli strutturali dell'interazione Hb/Banda 3 per mezzo di tecniche di \"computer chemistry\". 4- Studiodei meccanismi di produzione e di rilascio dell'ossido nitrico da parte degli eritrociti di animali antartici, artici e sub-polari. (literal)
Stato dell'arte
  • E' noto come l'Hb interagisca reversibilmente con la Banda 3 proteina transmembrana di peso molecolare pari a circa 93 kDa, che consente il trasferimento degli anioni tra l'ambiente esterno e il citosol e che rappresenta circa il 25 per cento delle proteine di membrana. Fra i derivati dell'Hb, la desossi-Hb mostra una affinita' per il dominio citoplasmatico della Banda 3 (CDB3) circa 100 volte maggiore di quella della ossi-Hb. Il dominio CDB3 e' anche sito di legame di alcuni enzimi della via glicolitica, tra cui la fosfofruttochinasi, la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi e la lattato deidrogenasi, e a causa di questa interazione gli enzimi vengono inibiti. Un nostro studio condotto su eritrociti di soggetti normali trattati con un cross-linker della Banda 3 (DIDS) ha dimostrato che la regolazione metabolica ossigeno-dipendente e' basata su una parziale inibizione della glicolisi nell'eritrocita ossigenato a causa della maggiore affinita' mostrata dagli enzimi glicolitici, rispetto alla ossi-Hb, per il dominio citoplasmatico della Banda 3. (literal)
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