Descrizione della commessa "Identificazione di Fattori Prognostici e Correzione dei Meccanismi d’Evasione del Carcinoma Colorettale dall’Immunità Innata con Cellule NK Derivate da Cellule Staminali Ematopoietiche (ME.P04.008)"

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• Descrizione della commessa "Identificazione di Fattori Prognostici e Correzione dei Meccanismi d’Evasione del Carcinoma Colorettale dall’Immunità Innata con Cellule NK Derivate da Cellule Staminali Ematopoietiche (ME.P04.008)" (literal)

Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi

• I risultati ottenuti in questo studio consentiranno (i) di trasferire importanti informazioni nell'area del management clinico dei pazienti con CCR per migliorarne la gestione clinica e patologica, (ii), potranno essere utilizzati per lo sviluppo di nuovi modelli d'immunoterapia specialmente per quanto riguarda studi sperimentali di bench-to- bed side per il trattamento di CCR in fase localmente avanzata , (iii) consentirà di creare banche di tessuti e sieri per l'impiego in ricerche collaterali. (literal)

Strumentazione

• Sono a disposizione dei partecipanti alla commessa le apparecchiature necessarie allo svolgimento dell'attività di ricerca. Per lo svolgimento di alcune tecniche di indagine ci si avvarrà delle competenze e delle strutture messe a disposizione dalle collaborazioni esterne. In dotazione: Sequenziatore automatico Genetic Analyzer ABI 3100 (Applied Biosystems) Thermal Cycler 9600,9700 (Applied Biosystems) Omogenizzatore Potter's (B. Braun) Lettore ELISA Camere sterili, dispositivi, microscopi, apparecchiature e impianti utilizzati per lo svolgimento delle attività relative alle colture cellulari Bagnomaria con agitazione Certomat WR Multibloc Heater Techne Dry-block 08-3 Microcentrifuga Eppendorf Centrifuge 5402 Spettrofotometro Beckman DUT 30 UV/VIS Centrifuga Varifuge Heraeus Centrifuga per piastre Centrifuge SIGMA 4-15C QIAGEN DNA Speed Vac DNA 110 Savant Apparato elettroforetico Biorad con celle per elettroforesi orizzontale Multidispensatrice Multipette Plus Eppendorf Transilluminatore e apparato per analisi dell'immagine MITSUBISHI (literal)

Tematiche di ricerca

• Identificare fattori prognostici è la tematica principale del progetto. Potenziali biomarcatori sono selezionati da risultati di collaborazioni tra il nostro Istituto e lo Swiss National Science Foundation (SNF). Dati preliminari definiscono CD16 un fattore prognostico nel CCR. Lo studio su CD30 identifica che questa molecola ha un ruolo omeostatico sulla risposta immunitaria che se alterato seleziona fenotipi patologici dannosi per l'organismo. Rilevante è che CD30 è espresso su cellule NK, dendritiche, macrofagi e linfociti ed è stato recentemente definito il recettore specifico della tioredoxina1 nella regolazione redox metabolica e funzionale della risposta delle cellule immunitarie all'ambiente extra cellulare. Si faranno indagini a questo livello per chiarire nostri dati in cui il CRC attiva un meccanismo di evasione dall'attività anti-tumorale NK e NK coltivate in presenza di linee cellulari di CRC (HCT116, Colo201, Colo205) diventavano apoptotiche e dopo necrotiche per contatto cellulare tra NK/CRC. Tale situazione implica forti limitazioni all'uso di protocolli NK d'immunoterapia e strategie che consentano di evitare questi inconvenienti sarebbero auspicabili. (literal)

Competenze

• Il ruolo clinico/patologico di CD16/CD30 sarà valutato con micro-array tessutali di CCR forniti dal Prof L.Terracciano,l'analisi statistica dalla Dr. I.Zlobec (Istituto di Patologia), Università di Basilea; la valutazione di infiltrato infiammatorio CD16+ del CCR dai Dr. G.Sconocchia e D.Calabrese.Parametri morfologici si valuteranno su array tessutali colorati con tecnica/immunoistochimica e analisi fenotipica di infiltrato infiammatorio da digestione enzimatica di almeno 20 pezzi operatori. La generazione di NK da cellule staminali di midollo osseo, tessuto adiposo, sangue periferico di almeno 20 donatori sarà svolto da Dr. G.Sconocchia, Prof G.Spagnoli collaborando con il Dr. A.Papadimitropoulos e il Prof. I.Martin.Il Prof. S.Ferrone farà da consulente per i meccanismi d'evasione di CCR da immunosorveglianza. Il significato clinico/patologico di CD30/CD16 sarà valutato su materiale biologico di pazienti con diagnosi di CCR nell'Istituto ITOI. Le valutazioni di immunologia cellulare dalle Dr P.Pellegrini, I.Contasta e A.M.Berghella; le analisi di biologia molecolare dalle Dr A.Aureli e A Canossi; T.Del Beato, G.Liberatore e P.Sebastiani svolgeranno attivita di supporto tecnico. (literal)

Potenziale impiego per processi produttivi

• Intendiamo produrre micro-array tessutali composti di circa 1400 lesioni colorettali da assemblare semiautomaticamente per l'analisi del CD30, mentre gli array per lo studio del CD16 sono già disponibili. Identificare reali fattori prognostici, biomarcatori e targets terapeutici per la stratificazione clinica diagnostica/terapeutica dei pazienti e la definizione di nuovi e più appropriati farmaci. (literal)

Tecnologie

• • Tecniche di sequenziamento genico (SBT). • Tecniche di analisi di frammento. • Amplificazione con primer sequenza-specifici (SSP). • Estrazione e quantificazione di acidi nucleici • PCR (Polimerase Chain Reaction)e RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction) • ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) • colture di sangue intero, di cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC), monociti, cellule dendritiche (mature e immature) e NK.. • separazione cellule CD14+ e cellule NK con metodica magnetica/anticorpo specifica . (literal)

Obiettivi

• Gli scopi di questo studio sono quelli di dimostrare che 1. L'espressione di CD16 e/o CD30 nell'infiltrato infiammatorio del CCR è un fattore prognostico positivo nel CCR che consente di stratificare questa popolazione in sottogruppi con prognosi diversa. 2. La parte CD16 e/o CD30 positiva dell'infiltrato infiammatorio è prevalentemente costituita da macrofagi e cellule T, mentre il ruolo delle cellule NK è trascurabile, poiché il CCR causa l'eliminazione delle cellule NK stesse. 3. L'uso di sistemi tridimensionali per il commitment di cellule staminali ematopoietiche consente di produrre cellule NK immature resistenti all'apoptosi dipendente dal CCR pur mantenendo un'attività anti-tumorale. (literal)

Stato dell'arte

• Il CCR è spesso caratterizzato da infiltrato infiammatorio di cellule in cui i linfociti T CD8+ contrastano la progressione(1), mentre non e' chiara l'influenza del sistema innato monocitico/macrofagico e natural killer(NK)(2). Le NK sembrano anti-neoplastiche mentre le cellule monocitiche-macrofagiche associate al tumore (MAT) sono di tipo1(M1) pro-infiammatorio anti-neoplastico e tipo2(M2) anti-infiammatorio pro-angiogenesi e neoplastico(3, 4). I monociti CD16+ sono circa il 10% dei totali(5) e nostri dati indicano in CD16 un fattore prognostico positivo nel CCR e che è probabilmente espresso su cellule a carattere macrofagico. Rilevante è che RCD30 è espresso sia su NK, monociti/macrofagi che linfociti T, regolandone i processi apoptotici(6-9) e che RCD30 è il recettore specifico della tioredoxina1 per l'equilibrio redox metabolico funzionale delle cellule immunitarie per rispondere all'ambiente extra cellulare(10). Nostri risultati mostrano che CD30 controlla l'omeostasi immuno/neurologica tra funzione di tipo1(inducente Th1), tipo2(Th2/Th17) e tipo3 (regolatoria) di Monociti e cellule dendritiche, dirigendo il tipo di differenziazione Th (in Th1, Th2, Th3 o Th17)(11-15) (literal)

Tecniche di indagine

• Per la produzione tridimensionale statica di NK si utilizzerà scaffold di collagene e per NK in fase dinamica, bioreattori integrati con scaffold di collagene o di ceramica su cui sono state seminate cellule staminali da varie sorgenti. L'attività anti-tumorale NK-immature sarà testata in vitro su linee di CCR(HCT116,colo201,colo205,LS180,SW480). Le valutazioni di immunologia cellulare su sangue periferico comprenderanno: colture(di base e con stimoli specifici) di linee cellulari e sangue intero; monociti, cellule dendritiche e NK dopo separazione magnetica/anticorpo specifica; determinazione nei surnatanti di sCD30,Trx,RTrx,sBcl2 e citochine Th. Lo studio di polimorfismi dei recettori Fc gamma, FCg RIIIa(CD16) e FCg RIIa(CD32), saranno eseguite su DNA genomico con PCR e sequenziamento genico; il polimorfismo di CD30 su analisi di frammenti e dei geni KIR con sequenziamento genico; le analisi con software dedicati.Su cellule e pezzo operatorio si valuterà l'espressione di: Trx/RTrx,CD30,CD14,CD16,CD56; fattori di trascrizione genica linea cellulare-specifici: Th1:T-bet,STAT4,STAT1; Th2:GATA3,D12S1644/IL-4-STAT; Th17:NR1F3/RORG, AP-1, APRF; Treg:AIID/DIETER, NFAT1/NFATP, MGF/STAT5 (literal)

Descrizione di

• Identificazione di Fattori Prognostici e Correzione dei Meccanismi d’Evasione del Carcinoma Colorettale dall’Immunità Innata con Cellule NK Derivate da Cellule Staminali Ematopoietiche (ME.P04.008) (Commessa)

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• Identificazione di Fattori Prognostici e Correzione dei Meccanismi d’Evasione del Carcinoma Colorettale dall’Immunità Innata con Cellule NK Derivate da Cellule Staminali Ematopoietiche (ME.P04.008) (Commessa)