Descrizione della commessa "Progettazione ed applicazioni di Nanobiotecnologie (MD.P06.022)"

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  • Descrizione della commessa "Progettazione ed applicazioni di Nanobiotecnologie (MD.P06.022)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • I biosensori sotto studio dovrebbero permettere di quantificare l'entità delle modifiche post traduzionali a livello intracellulare delle proteine coinvolte in patologie di rilievo, fornendo indicazioni utili allo sviluppo di nuove terapie. Infine, la realizzazione di peptidi in grado di veicolare farmaci in specifici comparti intracellulari permetterà un'azione selettiva di principi farmacologici nelle regioni di interesse. Potrebbero inoltre fornire future applicazioni diagnostiche. (literal)
  • I sistemi luminescenti sviluppati presentano importanti ricadute nel campo delle scienze biomediche, sia nel senso di una più approfondita comprensione dei processi biochimici a base della vita cellulare che per l'identificazione di biomarker specifici di patologie. In entrambi i casi ci si aspetta che le informazioni raccolte, oltre ad un progresso di conoscenza, possano portare allo sviluppo di nuove terapie. Inoltre, sistemi luminescenti ad alta risoluzione applicati in scienza dei materiali possono permettere di identificare le caratteristiche nanoscopiche di materiali polimerici permettendo una modulazione delle proprietà di questi ultimi. Nel campo della neurobiologia, l'analisi di traiettorie di singoli recettori neuronali rappresenta un utile strumento di indagine dei meccanismi che sottendono alla sopravvivenza, allo sviluppo e alla plasticità neuronale. Lo sviluppo di sistemi Lab-on-Chip potrebbe permettere ai sistemi diagnostici sviluppati di essere integrati in sistemi high-throughput e/o per diagnostica portabile. (literal)
Strumentazione
  • Microscopi confocali. Rilevatore TCSPC (time correlated spectroscopy photon counting) del tempo di vita di fluorescenza FCS (fluorescence correlation spectroscopy). Microscopia ad onda evanescente TIRF-M (Total Internal Reflection Fluorescence - Microscopy). Microscopia 3D a campo largo con software di deconvoluzione. Microscopia non-lineare per imaging in vivo accoppiato a registrazione elettrofisiologiche. Spettrofotometro e Spettrofluorimetro, Stop-flow. Nanobilancia. Strumentazione per manipolazione campioni biologici (PCR, incubatori, centrifughe). NMR (300 MHz). FPLC (Fast protein liquid chromatography) con rivelatore di assorbimento. HPLC (high performance liquid chromatography) con rivelatori di assorbimento e di indice di rifrazione. Laser pulsati infrarossi per l'eccitazione a due fotoni (automatico e manuale). Fotoacustica. Cluster IBM con 14 nodi biprocessore. (literal)
  • 1) 3 microscopi confocali, di cui due implementati con rivelatori TCSPC del tempo di vita della fluorescenza ed uno dotato di scheda autocorrelatrice per spettroscopia di correlazione di fluroescenza, 2) microscopio TIRF equipaggiato con sistema laser multilinea, 3) spettrofotometro e spettrofluorimetro, 4) laboratorio per la sintesi chimica equipaggiato con sistemi di purificazione HPLC con rivelatori di assorbimento ottico e di indice di rifrazione, 5) spettrometro multiprobe NMR (300 MHz), 6) sistema cromatografico per la purificazione di proteine (FPLC), 6) Camera pulita equipaggiata con tutto il necessario per la micro e nano fabbricazione (literal)
Tematiche di ricerca
  • Spettroscopia a singola molecola a uno e due fotoni. Fotofisica e fotochimica delle proteine fluorescenti. Disegno al calcolatore e produzione di nuovi mutanti fotocromici di proteine fluorescenti. Immobilizzazione di proteine tramite auto-assemblaggio su substrati funzionalizzati. Nuove tecniche per il monitoraggio ottico di eventi molecolari all'interno della cellula basate sia su molecole esprimibili geneticamente (proteine) che su nanocristalli di sintesi. Biosensori FRET intracellulari per l'analisi di modifiche post traduzionali di proteine. Rilascio intracellulare di profarmaci attivati dall'interazione con proteine o mediante stimoli luminosi esterni. (literal)
  • Spettroscopia a singola molecola a uno e due fotoni. Fotofisica e fotochimica delle proteine fluorescenti.Proteine fluorescenti fotocromiche per super-resolution imaging di campioni biologici.Sviluppo di sonde luminescenti organiche come sensori di parametri ambientali a livello intracellulare e in matrici polimeriche. Lab-on-Chip basati su onde acustiche di superficie.Substrati biocompatibili nanostrutturati e chip microfluidici per crescita cellulare guidata.Sistema per l'espressione ectopica di transgeni per studi di tracking di singole molecole di recettori di membrana.Studio delle dinamiche spazio-temporali a singola molecola di recettori neurotrofinici e dei fattori che influenzano tali dinamiche.Ottimizzazione e sviluppo di sistemi basati su dendrimeri o nanoparticelle.Sviluppo di metodologie multiscala e modelli Coarse Grained (CG) per simulazioni di sistemi biomolecolari su larga scala spaziotemporale.Applicazioni: GFPs;particelle e componenti virali;aptameri.Modellizzazione di sistemi per il drug delivery. Studio computazionale delle proprietà ottiche di proteine fluorescenti e altri fluorofori organici.Modellizzazione di proprietà spettroscopiche di proteine fluorescenti (literal)
Competenze
  • La commessa comprende competenze multidisciplinari relative a: tecniche sperimentali per l'imaging molecolare tramite spettroscopia di fluorescenza; imaging in vivo a 1- e 2-fotoni; sintesi di proteine ricombinanti; sintesi chimica di sonde luminescenti e di derivati bio-funzionalizzati; spettroscopia molecolare ad alta risoluzione; tecniche di calcolo numerico e di simulazione di dinamica molecolare con vari metodi (Quantum Chemistry, All-atom simulation e Coarse Grained); sintesi chimica e funzionalizzazione di nanoparticelle e dendrimeri; tecniche sperimentali per l'imaging in cellule vive e di spettroscopia UV/Vis, di fluorescenza, Raman e SERS; tecniche di propagazione e trasfezione di varie linee cellulari e cellule primarie; studi biochimici associati a verifiche funzionali di recettori o altre proteine; tecniche a singola molecola per lo studio delle dinamiche spazio-temporali; micro e nano fabbricazione; microscopia elettronica a scansione; microscopia a forza atomica. Quantum Chemistry calculations (Density Functional Theory), QM/MM hybrid calculations, All-atom simulations, Coarse Grained Method Development. (literal)
  • La commessa comprende competenze multidisciplinari relative a tecniche sperimentali per l'imaging molecolare tramite spettroscopia di fluorescenza, imaging in vivo a 2-fotoni, sintesi di proteine ricombinanti, sintesi chimica, metodologie computazionali per la modellizzazione molecolare. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • I sistemi fotocromici basati su proteine possono avere importanti ricadute sull'elettronica come metodi alternativi per l'immagazzinamento di informazione. In particolare, la natura proteica di questi sistemi dovrebbe consentire la modulazione fine delle proprietà ottiche mediante modificazioni razionali della struttura primaria, suggerite dalla modellizzazione computazionale. (literal)
  • I sistemi luminescenti sviluppati possono avere importanti ricadute in ambito di scienza dei materiali, in particolare nel controllo dei processi produttivi su matrici biologiche e polimeriche. L'ingegnerizzazione di substrati biocompatibili per la crescita cellulare guidata potrebbe essere impiegata per lo sviluppo di protesi o innesti innovativi. (literal)
Tecnologie
  • Metodi di biologia molecolare per la realizzazione di vettori di espressione in eucarioti e procarioti; tecniche di purificazione proteica; tecniche di sintesi organica. Protocolli di litografia non convenzionale (nanoimprint lithography, soft lithography) per la nanolavorazione di polimeri biocompatibili. Modelizzazione molecolare su larga scala e dinamica molecolare. Elettrofisiologia e imaging funzionale a 2-fotoni. (literal)
  • Tecniche di litografia ottica ed elettronica per micro e nanofabbricazione, metodi di hot-embossing e nanoimprint lighography su materiali termoplastici biocompatibili (COC, PS, PET, PLA, PLGA). Metodi di sintesi chimica, di purificazione e di caratterizzazione strutturale di composti organici, luminescenti e non. Ingegnerizzazione e produzione di proteine ricombinanti. Tecniche di labeling dei recettori di membrana basate su corte sequenze peptidiche (ad esempio, il tag ACP) geneticamente fuse alla proteina di interesse che permettono l'attacco specifico e covalente di specifici substrati (ad esempio, biotine poi complessate con Quantum Dots streptavidinati). Quantum Chemistry calculations (Density Functional Theory), All-atom simulations, Coarse Grained Method Development (literal)
Obiettivi
  • Progettazione e sviluppo di nuove proteine fluorescenti con proprietà fotofisiche che consentono il loro impiego come sonde in applicazioni di nanoscopia, e single-molecule intracellular sensing. Progettazione e sviluppo di nuove sonde fluorescenti organiche con caratteristiche fotofisiche atte al monitoraggio di parametri ambientali (polarità, viscosità, potenziale elettrico). Sviluppo di molecole luminescenti per il monitoraggio di proprietà di materiali polimerici. Studio delle dinamiche spazio-temporali a singola molecola di recettori neuronali (TrkA, TrkB, p75) e dei fattori che influenzano tali dinamiche. Studio della fotofisica di nanoparticelle e/o dendrimeri funzionalizzati con fluorofori. Applicazioni allo studio della dinamica delle proteine verdi fluorescenti in ambiente che mimi in maniera realistica quello cellulare. Comprensione dei meccanismi alla base dello spectral tuning nelle proteine fluorescenti. Studio delle configurazioni di peptidi coniugati a nanosfere di oro. Progettazione e sviluppo di sistemi microfluidici basati su onde acustiche di superficie. Fabbricazione di substrati biocompatibili nanostrutturati per culture cellulari guidate. (literal)
  • Progettazione e sviluppo di nuove proteine fluorescenti con speciali proprietà ottiche, a partire dalle strutture molecolari di proteine fluorescenti note (GFP, BFP, dsRED, AsCP,eqFP611...). Sviluppo di nuove tecniche per il monitoraggio intracellulare di singoli eventi molecolari, utilizzando marcatori ottici di natura proteica, organica e inorganica. Biosensori FRET intracellulari l'analisi di modifiche post traduzionali di proteine. Biosensori intracellulari per metaboliti quali ioni cloro e idrogeno. Rilascio intracellulare di profarmaci attivati dall'interazione con proteine o mediante stimoli luminosi esterni. (literal)
Stato dell'arte
  • Lo sviluppo delle tecniche di microscopia di fluorescenza ha fornito uno strumento importante per le scienze mediche e biologiche, rendendo possibile la visualizzazione di eventi molecolari in tessuti e in cellule viventi, con risoluzione sub-micrometrica. Il successo di questa tecnica è legato alla disponibilità di fluorofori, in grado di assorbire la radiazione luminosa in prossimitá di una specifica lunghezza d'onda riemettedola a lunghezza d'onda maggiore. Le proteine fluorescenti costituiscono una classe di fluorofori a sè stante, in grado di essere codificata geneticamente. Infatti, il loro cromoforo si forma in maniera autocatalitica. Grazie a questa proprietà unica, il loro gene può essere espresso in differenti organismi e quindi usato per visualizzare in vivo la morfologia cellulare in svariati preparati biologici. Tale gene può essere fuso a proteine di interesse per lo studio della dinamica intracellulare o delle interazioni intermolecolari. Lo studio della fotofisica di queste proteine e la possibilità di manipolarne le proprietà spettrali e chimico-fisiche tramite mutagenesi sito-specifica sono aspetti cruciali per fornire nuovi strumenti all'imaging biomolecolare. (literal)
  • Recentemente sono state sviluppate tecniche di imaging (nanoscopia) che permettono di scendere ad una risoluzione spaziale ben al di sotto del limite di diffrazione ottico (ca 200 nm per radiazione nell'intervallo visibile dello spettro).Tutte le tecniche di imaging dipendono criticamente dalle caratteristiche delle sonde luminescenti impiegate, così come dalla sua possibilità di essere coniugate a biomolecole di interesse.Le proteine fluorescenti (FPs) rappresentano una strategia di elezione per il bioimaging, poichè l'espressione di fluorescenza è codificata geneticamente e proteine di fusione sono rapidamente accessibili; inoltre la modifica della sequenza primaria delle FPs consente una parziale modulazione delle proprietà fotofisiche della sonda.L'utilizzo di sonde di sintesi consente di ottenere elevatissime sensibilità (singola molecola), risoluzione spaziale (nanoscopia) e proprietà ottiche disegnate sulle base delle specifiche applicazioni.La progettazione e lo studio di sonde proteiche o organiche, con particolare attenzione alla possibilità di manipolarne le proprietà spettrali e chimico-fisiche sono aspetti cruciali per fornire nuovi strumenti all'imaging biomolecolare. (literal)
Tecniche di indagine
  • Spettroscopia di assorbimento e fluorescenza d'insieme e di singola molecola; spettroscopia Raman e Raman SERS; spettroscopia multifotone; spettroscopia di fluorescenza risolta nel tempo (stop flow, pH jump, fotolisi, fotoacustica); spettroscopia di correlazione di fluorescenza; spettroscopia NMR di molecole organiche; pump and probe con innesco di fotolisi e risoluzione al nanosecondo. Metodi di imaging ad alta sensibilità e risoluzione (FRAP, FRET, FLIM, FCS, metodi di nanoscopia quali PALM e STED) di cellule e di tessuti in vivo. TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) accoppiata all'uso di una telecamera tipo Electron Multiplied Charge Coupled Device (EM-CCD) ad alta sensibilità. Nanoparticelle metalliche e dendrimeri funzionalizzati vengono testati tramite elettroforesi in gel, SERS, tecniche di fluorescenza anche avanzate (tempo di vita, FCS, tecniche a singola molecola), misure di diffusione di luce dinamica (DLS), anche del potenziale zeta. Microscopia elettronica a scansione e microscopia a forza atomica. (literal)
  • Spettroscopia di assorbimento e fluorescenza d'insieme e di singola molecola; spettroscopia Raman e Raman SERS; spettroscopia multifotone; spettroscopia di fluorescenza risolta nel tempo (stop flow, pH jump, fotolisi, fotoacustica); spettroscopia di correlazione di fluorescenza; spettroscopia NMR di molecole organiche; pump and probe con innesco di fotolisi e risoluzione al nanosecondo. Imaging avanzati (FRAP, FRET, FLIM, FCS) di cellule e di tessuti in vivo. Metodi computazionali per la dinamica molecolare sia ab initio che basata su campi di forza empirici, sia all-atom che coarse grained. Valutazione di affinità molecolare. Predizione delle proprietà spettrali di molecole organiche in diversi micro ambienti tramite tecniche ibride quanto-meccaniche e di meccanica molecolare (QM/MM). (literal)
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