Descrizione della commessa "Studio della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in risposta a stress. Fattori che controllano lo splicing dei mRNA in cellule normali e nei tumori. (SV.P13.001)"

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  • Descrizione della commessa "Studio della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in risposta a stress. Fattori che controllano lo splicing dei mRNA in cellule normali e nei tumori. (SV.P13.001)" (literal)
Potenziale impiego per bisogni individuali e collettivi
  • La ricerca studia il ruolo dello splicing alternativo e dell'RNA nella progressione tumorale e nella risposta a condizioni stressanti, un campo fino ad ora sottovalutato. In particolare: A- studieremo l'effetto dell'alta densità cellulare che nei tumori si accompagna a ipossia e mancanza di nutrienti. Oltre a migliorare la nostra comprensione del processo tumorale questo potrebbe offrire nuovi e potenzialmente interessanti approcci terapeutici per la cura dei tumori. B- Definiremo il ruolo, fino ad ora sottovalutato, della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica (in particolare dello lo splicing alternativo) nel processo della angiogenesi coinvolto nella progressione metastatica di un tumore. C- Le osservazioni che la deregolazione del metabolismo dell'RNA, attraverso la formazione di ibridi DNA-RNA, può causare instabilità genomica potrebbe portare all'identificazione di nuovi bersagli per terapie più mirate contro il cancro e la neurodegenerazione. E- Migliorare le nostre conoscenze relative alla biologia dei tumori cerebrali che tutt'ora rappresentano un difficile problema terapeutico con sopravvivenze nel caso del glioblastoma in media inferiori ad un anno. (literal)
Strumentazione
  • Clonaggi, isolamento di RNA totale, Northern blotting, RT-PCR e real-time PCR, western blotting, colture cellulari, microscopia a fluorescenza e confocale. Allestimento di colture primarie da frammenti di tumori umani ottenuti al momento dell'intervento chirurgico. Elettroforesi bidimensionale. Purificazione di proteine su colonne d'affinità. Allestimento di preparati istologici per microscopia luce ed elettronica. Manipolazione del lievito S. cerevisiae. FACS analisi. Gel elettroforesi bidimensionale per analizzare gli intermedi di replicazione del DNA. Immunoprecipitazione della cromatina per valutare il legame di specifiche proteine o la formazione di ibridi di DNA-RNA sia a specifiche regioni del DNA che a livello genomico. Immunoprecipitazioni di cromatina (ChIPs) Strumenti per gel elettroforesi (proteine ed acidi nucleici), termociclatori, microscopio a fluorescenza dotato di CCD camera e termostato, confocale Leica, centrifughe ed ultracentrifuga, camera radioattiva, camera sterile per colture cellulari, laboratorio attrezzato per esperimenti di Biologia Molecolare, real-time PCR, Typhoon (literal)
Tematiche di ricerca
  • Lo splicing alternativo è un complesso network di regolazione genica intermedio tra trascrizione e modificazione post-traduzionale delle proteine. Rappresenta un meccanismo ideale per modulare finemente la risposta cellulare a stimoli dell'ambiente compreso il micro-ambiente tumorale. La ricerca si propone: A- di comprendere i meccanismi che controllano i livelli del fattore di splicing SRSF1, un'oncoproteina, in risposta alle condizioni di crescita delle cellule; B- studiare il ruolo dello splicing alternativo nella regolazione dell'angiogenesi tumorale; identificazione di nuove isoforme proteiche per lo sviluppo di terapie anti-angiogeniche; C- studiare in che modo difetti nel macchinario di splicing e di trascrizione possono influenzare la replicazione del DNA. Verrà analizzata la proteina Sen1 con approcci genetici, genomici e di biologia molecolare; D- caratterizzare il ruolo di RNA corti non codificanti nella riparazione del DNA. E- analizzare le varianti di splicing di Shc nei tumori cerebrali. (literal)
Competenze
  • La commessa ha competenze in: 1) metodiche per lo studio dell'RNA (isolamento di RNA, Northern blotting, trascrizione in vitro, purificazione e clonaggio ed analisi di small RNA, primer extension); 2) biologia cellulare (colture cellulari in varie condizioni di crescita, transfezioni transienti e stabili, immunofluorescenza, ibridazioni in situ, analisi al microscopio confocale di cellule fissate ed in vivo, marcature in vivo); 3) biologia molecolare (clonaggi, espressione di proteine in sistemi eterologhi, RT-PCR e real-time PCR, Immunoprecipitazione, traduzione in vitro, Western blotting, marcatura di proteine in vivo, vaglio di collezioni di cDNA con anticorpi o con saggi funzionali tipo One- Two- e Three- hybrid in lievito; RNA interference; immunoprecipitazioni, analisi per 2D Gel degli intermedi replicativi, chormatin immunoprecipitation); 4) analisi biochimiche (purificazioni di enzimi e frazionamenti cellulari ); 5) genetica del lievito; 6) analisi per 2D gel per lo studio dell'interferenze tra la trascrizione e replicazione del DNA; 7) Sceening genomici SGA ed esperimenti di ChIP-chip; 8) Esperienza di neurochirurgia e neuro-oncologia clinica e sperimentale. (literal)
Potenziale impiego per processi produttivi
  • La ricerca si qualifica come una ricerca di base e quindi non è direttamente coinvolta in processi produttivi. Tuttavia alcuni dei prodotti potrebbero avere ricadute in questo senso. Ad esempio ci aspettiamo che l'analisi dello splicing alternativo possa portare allo sviluppo di kit diagnostici e in prospettiva allo sviluppo di tecnologie per \"curare\" lo splicing alternativo di specifici geni nei tumori. Inoltre, l'identificazione di nuove isoforme di splicing espresse selettivamente dalle cellule endoteliali tumorali permetterà di sviluppare terapie anti-angiogeniche anti-tumorali. L'identificazione dei pathway coinvolti nel mantenimento della stabilità genomica permetterà identificare potenziali nuovi targets nella terapia antitumorale, oltre a generare, come accennato sopra, una serie di reagenti di potenziale valore commerciale. Infine la creazione di test diagnostici basati sulla valutazione della proteina Shc3 nei tumori cerebrali . Isolamento di piccole molecole che regolino l'attività di Shc3 per la terapia mirata dei tumori cerebrali. (literal)
Tecnologie
  • Per lo sviluppo della ricerca ci avvarremo di differenti tecnologie di Biologia Molecolare, Biologia Cellulare e Biochimica e Biologia Computazionale. In particolare svilupperemo modelli cellulari che permetteranno di rispondere a problemi chiave della nostra ricerca come ad esempio il ruolo di differenti signalling pathways nella modulazione dello splicing alternativo e nel mantenimento della stabilita' genomica. Studieremo anche i meccanismi molecolari che controllano i livelli dei fattori di splicing in risposta alla densità cellulare. Una parte della commessa analizzerà i meccanismi che proteggono le cellule dal danno al DNA indotto dall'interferenza tra i processi di replicazione e trascrizione del DNA. La deregolazione di questi meccanismi e' alla base di patologie umane come i tumori e alcune sindromi neurodegenerative. Infine verrà fatta un'analisi proteomica di immunoprecipitati e pull down tramite spettrometria di massa al fine di identificare potenziali interattori di Shc3. (literal)
Obiettivi
  • In senso lato studiare il coinvolgimento del metabolismo dell'RNA nel definire l'identità cellulare, il danno sul DNA e la risposta al danno. In particolare: A- studiare i meccanismi che regolano lo splicing dei trascritti in relazione al metabolismo cellulare. Valuteremo inoltre l'effetto che tale regolazione possa avere sulle proprietà staminali delle cellule tumorali. B- comprendere il ruolo dello splicing alternativo nell'angiogenesi tumorale e identificare nuovi bersagli terapeutici in isoforme di splicing di proteine di membrana; C- caratterizzare come la deregolazione della trascrizione, interferendo con la replicazione, possa generare riarrangiamenti genomici attraverso l'accumulo di strutture patologiche di ibridi di DNA-RNA; D- comprendere dei meccanismi molecolari dell'attivazione del DNA damage reponse. In particolare investigheremo la genesi dei cosiddetti DDRNA ed il loro meccanismo di azione nella regolazione del DNA damage response; E- studiare l'espressione dei geni per le proteine Shc nei principali tumori cerebrali primitivi umani e identificare i partner molecolari di Shc3. (literal)
Stato dell'arte
  • La quasi totalità dei trascritti dei geni umani subiscono splicing alternativo (AS). I programmi di AS sono deregolati nei tumori a causa di una alterata attività o espressione dei fattori di splicing. A- Studieremo l'effetto di condizioni stressanti nel micro-ambiente del tumore (densità cellulare, ipossia, danno sul DNA, iper-osmosi, scarsità di nutrienti) sull'attività dei fattori di splicing. B- Comprendere la biologia delle Endotelial Cells (ECs) e la regolazione dell'angiogenesi, indispensabile per lo crescita dei tumori e la formazione di metastasi. C- L'instabilità genomica è associata a tumori e neurodegenerazione nell'uomo ed è causata da eventi di rottura e riparazione aberrante del DNA. Studi nell'uomo e in organismi modello suggeriscono che la trascrizione e lo splicing possono destabilizzare la forcella replicativa. D- La formazione dei foci di DDR sono dipendenti dalla sintesi di piccole molecole di RNA la cui generazione dipende da DICER e DROSHA. E- La famiglia dei geni Shc comprende 4 elementi che danno origine a numerose proteine in seguito a splicing alternativo. Viene studiata l'espressione delle varie isoforme nei tumori. (literal)
Tecniche di indagine
  • L'analisi dello splicing alternativo in un modello di EMT o di angiogenesi in vitro basato sulla densità cellulare utilizzerà: 1) Saggi di splicing in vivo che basati su impiego di minigeni trasfettati in cellule umane e analisi dei trascritti con RT-PCR; 2) identificazione di vie di trasduzione del segnale coinvolte nella regolazione dello splicing (Western blotting con anticorpi specifici per forme fosforilate di chinasi e inibitori farmacologici); 3) identificazione dei fattori di splicing coinvolti e dei meccanismi che controllano il livello di questi fattori durante EMT in vitro, 4) Uso di oligonucleotidi e siRNA; 4) Produzione di cloni cellulari stabili; 5) costruzione di mutanti in lievito; 6) saggi di chromatin immunoprecipitation per valutare la connessione tra splicing alternativo e organizzazione cromatinica. (literal)
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